Спосіб кріоконсервування біооб’єктів

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к консервированию суспензий живых клеток и зародышей путем замораживания. Известен способ консервирования спермы включающий разбавление спермы средой, содержащей в качестве криопротектора глицерин с температурой кристаллизации + 18,9°С, который проникает в протоплазму клетки [Polge, С. Nature (London), 1951, 167, 949-950]. Недостатком известного способа является гибель в процессе замораживания 40-60% биологических клеток. Известен способ консервирования, при котором вместо глицерина в качестве проникающего криопротектора используют диметилсульфоксид с точкой замерзания 18,55°С [Lonebck I. Е. Bishog D, W. Nature (London), 1959,183,1394-1395]. Недостатком этого способа является токсичность диметилсульфок-сида и низкий выход жизнеспособных клеток. Известен также способ замораживания спермы производителей, по которому после получения, сперму обрабатывают желточно-цитратно-лактозной средой с глицерином, а перед замораживанием ее дополнительно разбавляют лактозо-цитратной средой с глицерином [Авт. ев СССР Ns 523693, кл. А 61 D 7/02, 1976]. При этом способе выход жизнеспособных клеток не увеличивается. Кроме того, недостатком всех известных способов криоконсервации биологических объектов является то, что использование в качестве криопротектора глицерина, диметилсульфоксида, этиленгликолей, полиэтиленоксидов и др. не позволяет в дальнейшем применять лиофильное высушивание законсервированного материала, т. к. перечисленные соединения в водных растворах практически не рублимируют и уже при минусовых температурах переходят в жидкое состояние, вызывая гибель живых объектов. Задачей изобретения является повышение уровня сохранения жизнеспособности биологических объектов и обеспечение возможности их лиофильного высушивания без фазового перехода криопротекторной среды, что станет основой для разработки альтернативного способа консервации живых биологических объектов в высушенном состоянии. Для решения поставленной задачи в известном способе криоконсервации биообъектов, в частности спермы, яйцеклеток и т. д. включающем получение, разбавление, жел-точно-цитратно-лактозной средой с криоп-ротектором и повторное разбавление лактозо-цитратной средой с криопротектором, эквилибрацию и замораживание согласно изобретению обработку объектов ведут средами с белковым криопротектором, температура кристаллизации которого 1,0-1,5°С, при следующем соотношении ингредиентов: При поиске по источникам патентной и научно-технической информации не выявлены способы криоконсервации биообъектов с признаками сходными с отличительными признаками заявленного технического решения, что подтверждает новизну и изобретательский уровень предлагаемого решения. Осуществляется способ следующим образом. К 63 мл 11 % раствора лактозы добавляют 30 мл желтка и 7 мл, белкового криопротектора, хорошо перемешивают ингредиенты и при температуре +38°С разбавляют 1:1 с эякулятом и выдерживают при комнатной температуре 5-10 минут, после чего проводят повторное разбавление эякулята второй средой. Для повторного разбавления готовят среду следующим образом: 100 мл дистиллированной воды нагревают до 90°С, добавляют 6,0 г лактозы- перемешивают до полного- растворения. В полученный раствор добавляют 1,4 г цитрата натрия, охлаждают и добавляют 5,0 мл раствора белкового криопротектора (0,25 мг/1 мл). Ингредиенты хорошо перемешивают и разбавляют эякулят повторно второй средой в соотношении 1:10. Окончательно разбавленную сперму расфасовывали, законсервировали. Результаты исследований приведены на разведенных эякулятах. При статической обработке не получено достоверных отличий (Р>0,1), что говорит о том, что предложенный криопротектор обладает сходными криозащитными свойствами с глицерином. Предложенный криопротектор является веществом природного происхождения и не оказывает токсичного воздействия на спермии, как глицерин, (изменения, например, акросомы: разбухание, разрывы, деформации) при совместном культивировании в течение 5 часов. Результаты представлены в табл. 1 и 2, и его механизм криопротекции отличный от такового известных криопротекторов. Опыт проведен на свежеполученных эякулятах с активностью не ниже 8 баллов. Из табл. 1 и 2 видно, что белковый криопротектор с течением времени при культивировании не обладает токсичностью (Р>0,1), в то время как глицерин обладает выраженной (Р