Спосіб визначення чутливості нюхового аналізатора і пристрій для його здійснення

1 Спосіб визначення чутливості нюхового аналізатора шляхом дії на тварину в олфактометричній камері одарованого повітря і реєстрація адекватної поведінкової реакції, який відрізняється тим, що у тварин в камері виробляють локомоторну активнозахисну реакцію на запах при больовому подразненні кінцівок, після чого проводять тестування нюхово! чутливості у вільнорухомої тварини, почергово подаючи в камеру неодороване та одороване повітря з заданими концентраціями запахової речовини і враховуючи кількість правильних локомоторних відповідей для визначення граничної ефективної концентрації запаху як показника нюхової чутливості. 2 Пристрій для визначення чутливості нюхового аналізатора, що містить олфактометричну камеру, з'єднаний з нею дозатор повітряних запахових сумішей та джерело запаху, який відрізняється тим, що олфактометрична камера виконана прямокутною, прозорою і герметичною, приєднана до відсмоктуючого компресора для створення в ній стабільного повітряного потоку і розділена на два ідентичних відділи з електропровідною підлогою в кожному з них для больового подразнення кінцівок тварини та з перфорованими трубками для рівномірної подачі повітряного потоку від дозатора, який має поліетиленові ємності для повітря і запахових сумішей, котрі через клапани почергово подають в камеру з цих ємностей, об'єм кожної з яких вибирають з 10-ти разовим (або більше) перевищенням об'єму камери, розміри якої, в свою чергу, визначають залежно від виду (розмірів) піддослідних тварин, а джерело запаху виготовлене з під'єднаної до нагнітаючого повітряного компресора хімічної склянки Тищенка з розміщеним в ній контейнером (ампулою) для пахучої речовини та з'єднаної з нею поліетиленової ємності для маточної (вихідної*) запахової суміші, яку в розрахованих кількостях подають в ємності дозатора за допомогою шприца. Винахід стосується фізіології сенсорних систем організму і може знайти застосування в фізіології аналізаторів та вищої нервової діяльності, психофізіології та етології. Відомі способи визначення нюхової чутливості у людини шляхом пред'явлення набору пляшечок з різними концентраціями запахових речовин (1) або набору смужок, імпрегнованих запаховими речовинами (2). Ці способи здійснюють без додаткових спеціальних пристроїв, оскільки нюхові пороги визначають на підставі усної відповіді людини. При дослідженні нюхового аналізатора у тварин момент сприйняття запаху оцінюють за руховою активністю, наприклад, орієнтованою реакцією (3) чи харчовою реакцією (4), або за такими фізіологічними показниками, як електрокардіограма (5) чи частота дихання і серцевих скорочень (6). Головними недоліками вищезгаданих способів є: неточність результатів через неод нозначність та нестабільність поведінкових реакцій, особливо при багаторазовому тестуванні, або складності реалізації, пов'язані з необхідністю хірургічного вживления електродів і реєстрацію . електрофізіологічних реакцій. Відомий спосіб тестування нюхової чутливості на основі призвичаєння тварини до одорованої певними запахами їжі з наступною оцінкою пошукової поведінки в ящику з 20-ма ідентичними го-дівницями, з яких 4 містять одоровану харчову кульку (7). Обмеження у використанні цього способу пов'язане з тим що він придатний лише для виявлення наявності нюхової чутливості, а не її кількісного вимірювання через відсутність можливості дозованої подачі запаху в різних концентраціях. Найбільш близьким до запропонованого спо-. собу є спосіб визначення нюхової чутливості, в якому поведінковим показником нюхового сприйняття слугує умовнорефлекторна інструментальна о> о> 34911 реакція натискання передньою кінцівкою на важіль для отримання спраглою твариною води (8). До недоліків цього способу слід віднести методичні складності вироблення неприродньої інструментальної' реакції та необхідність утримання тварин на зневодненій дієті для виникнення спраги, а також нестабільність рівня питтєвої мотивації в ході дослідження і негативний вплив жорсткого обмеження рухової активності тварини на її функціональний стан, що може впливати на надійність результатів. Відомі пристрої для дозування запахових речовин, наприклад, олфактометр з мікроманіпулятором і 6-ти канальною скляною канюлею для виштовхування з неї певних об'ємів хімічних речовин під дією імпульсів стиснутого повітря з заданими параметрами (9). Обмеженість застосування даного олфактометра полягає в тому, що він призначений для визначення чутливості переважно окремих хемосенсорних структур, наприклад, ділянок рецепторного епітелію нюхового аналізатора, а не загальної нюхової чутливості. у інтактної тварини. Найбільш близьким до запропонованого пристрою є олфактометр для дрібних тварин (8), який складається з олфактометричної камери з вмонтованими в неї резервуаром для подачі води тварині, маніпулятором для здійснення інструментальної рухової реакції і фотодатчиком для її реєстрації, а також системи подачі запахових сумішей, яка забезпечує очистку повітря (активованим вугіллям) та нагнітання його через флакони з пахучою речовиною і через змішувач в одораційну камеру до оральної зони тварини. Основні недоліки описаного олфактометра" складність конструкції олфактометричної камери, пов'язана з використанням штучної інструментальної питтєвої реакції, та технічна складність системи подачі запахів, пов'язана з особливостями процедури дозування запахів з заданою концентрацією і попередньою очисткою повітря, а також необхідність комп'ютерного управління такою складною установкою. В основу винаходу поставлено задачу визначення чутливості нюхового аналізатора шляхом дії на тварину дозованих запахів та виявлення за допомогою виробленої поведінкової реакції їх мінімальної ефективної концентрації як кількісного показника нюхової чутливості. Поставлена задача досягається тим, що в способі визначення чутливості нюхового аналізатора шляхом дії на тварину одорованого повітря і реєстрації адекватної поведінкової реакції згідно запропонованого винаходу у тварин виробляють в олфактометричній камері локомоторну активно-захисну реакцію на запах, після чого в камеру окремими порціями подають одороване цим запахом повітря,. поступово зменшуючи концентрацію запаху в ньому та реєструючи поведінкову відповідь (локомоторну реакцію) на подачу кожної порції. Зникнення поведінкових відповідей тварини при певній (зниженій) концентрації запаху свідчить про досягнення межі сприйняття даного запаху, а попередня ефективна концентрація є показником (порогом) нюхової чутливості. Поставлена задача досягається також тим, що в пристрої для здійснення запропонованого способу прозора олфактометрична камера розділена на два відділи з металевою підлогою, що дозволяє викликати природню локомоторну захисну реакцію (перебігання) при електричному больовому подразненні кінцівок тварин і візуально реєструвати її поведінку, а шляхом поєднання больового і запахового подразників (при їх одночасній дії) виробляти умовнорефлекторну локомоторну реакцію на сам запах, яка в подальшому тестуванні нюхової чутливості слугує свідченням того, що тварина відчуває дану концентрацію запаху в повітряній суміші, яка надходить в камеру з накопичувальної ємності дозатора запаху. Сукупність суттєвих ознак запропонованого способу усуває недоліки відомих способів і надає можливість точного кількісного визначення чутливості нюхового аналізатора піддослідних тварин завдяки використанню простої і водночас інформативної моделі природньої поведінки, яка не потребує утримання тварин на спеціальних дієтах, легко виробляється в лабораторних умовах, забезпечує стабільність поведінки незалежно від фізіологічного стану (голод, спрага тощо) і часового фактора впродовж доби, не потребує складного чи дорогого обладнання для її реалізації та забезпечує надійність результатів дослідження. Пристрій для здійснення запропонованого способу, на відміну від відомих подібних пристроїв, не потребує обладнання для хімічної очистки повітря і спеціальних вимог для нагнітаючої апаратури, оскільки забезпечує стабільний повітряний потік через олфактометричну камеру завдяки використанню відсмоктуючого (а не нагнітаючого) компресора при пасивному витоку запахових повітряних сумі. шей з накопичувальних ємностей, забезпечує широкий діапазон і високу точність дозування запахів, відрізняється простотою конструкції і доступністю для виготовлення в пересічній дослідницькій лабораторії. Спосіб відтворюється наступним чином. У . досліджуваної тварини в олфактометричній камері виробляють безумовну локомоторну активно-захисну реакцію на больове подразнення кінцівок електричним струмом. На основі цієї реакції далі • виробляють таку ж умовнорефлекторну реакцію на запах, багаторазово поєднуючи дію запаху (в концентрації, на порядок вищій нюхового порогу людини) з електричним подразненням кінцівок, до досягнення кри герію 80% (або більше) правильних локомоторних реакцій. Після цього тестують чутливість нюхового аналізатора шляхом подачі в олфактометричну камеру (за допомогою дозатора) повітряної запахової суміші з поступовим зниженням концентрації запаху, наприклад, на порядок в кожному наступному тестуванні, до зменшення кількості правильних реакцій нижче рівня 50%, а попередню мінімальну ефективну концентрацію вважають показником нюхової чутливості в першому наближенні. При необхідності більш точного визначення цього показника продовжують тестування, починаючи з мінімальної ефективної концентрації і використовуючи більш тонку градацію зниження концентрації запахової речовини до досягнення бажаної або необхідної точності вимірювання нюхової чутливості. Пристрій для здійснення пропонованого способу зображений на фігурі складається з 34911 олфактометричної камери (1), з'єднаного з нею дозатора запахових сумішей (2) та джерела запаху (3). Камера (1) має виготовлений з прозорого пластика корпус прямокутної форми (4) з герметично прилягаючою зйомною кришкою (5), штуцер (6) для підключення до відсмоктуючого повітряного компресора (ВК). перфоровані трубки (7. 8) для подачі в камеру повітря та запахових сумішей від дозатора, перегородку (9), що частково ділить камеру на два однакових відділи, в кожному з яких вмонтовано електропровідну підлогу (10, 11) з металевих прутків для больового подразнення кінцівок тварини лабораторним електростимулятором (ЕСЛ) через тумблер (12), що подає електричну напругу на підлогу лівого чи правого відділу камери. Лінійні розміри камери вибирають залежно від виду (розміру) піддослідних тварин так,щоб тварина могла вільно розвертатись в одному відділі камери при дії больових чи нюхових подразників і здійснювати захисну реакцію переходу в інший відділ, що наприклад, для лабораторних щурів мінімально і достатньо складає 30x15x25 см. Дозатор запахових сумішей (2) має п'ять (або більше) виготовлених з поліетиленової плівки ємностей (Є-1 - для повітря, Є2-Є5 - для запахових сумішей), які через поліетиленові трубки з перекриваючими клапанами (К1-К5) та багатоходовий перемикач потоку (13) з'єднують з перфорованими трубками (7, 8) олфактометричної камери. Місткість ємностей вибирають залежно від розмірів олфактометричної камери і об'ємної швидкості повітряного потоку через неї, які, в свою чергу, залежать від виду піддослідних тварин. Для лабораторних щурів, наприклад, достатня кількість кожної ємності становить 50 куб.дм. Джерело запаху (3) зібране з хімічної склянки Тищенка (14) з вміщеною в неї ампулою для запахової речовини (15), виготовленої з поліетиленової плівки ємності (ЄМ) для маточної (вихідної) запахової суміші, шприца (16) для відбору цієї суміші та з'єднуючих поліетиленових трубок з затискачами (17, 18.19). Перед проведенням олфактометричного дослідження ємності Є2-Є5 заповнюють запаховими сумішами з послідовним градуальним зниженням концентрації, наприклад, на порядок, а ємність Є1 - кімнатним повітрям за допомогою нагнітаючого компресора, наприклад, апарату штучної вентиляції легенів. Для приготування запахових сумішей склянку Тищенка (14) з'єднують з нагнітаючим компресором (НК) і заповнюють ємність (ЄМ) маточною запаховою сумішшю, після чого цю суміш у відповідних кількостях вводять шприцом в ємності (Є2-Є5) і наловлюють їх кімнатним повітрям до заданого об'єму за допомогою нагнітаючого компресора. Абсолютну концентрацію маточної' запахової суміші попередньо визначають, виходячи з об'ємної продуктивності нагнітаючого компресора та інтенсивності випаровування запахової речовини, що встановлюють експериментально як технічну характеристику для конкретного олфактометричного пристрою і досліджуваної речовини. Залежно від мети дослідження можна також визначати відносну концентрацію шляхом доведення концентрації маточної суміші до порогу нюхової чутливості людини з наступним градуальним розведенням її в запахових ємностях (Є2-Є5). Після такої підготовки дозатора, при перекритих запахових клапанах (К2-К5) і відкритому повітряному клапані (К1), поддослідну тварину садять в Олфактометричну камеру, яку герметично закривають кришкою (5) і вмикають відсмоктуючий компресор для створення постійного потоку повітря через камеру. Маніпулюючи клапанами (К1-К5) і перемикачем (13), подають в камеру запахові суміші з ємностей (Є2-Є5) і визначають мінімальну концентрацію, на яку тварина відповідає попередньо виробленою локомоторною реакцією переходом з одного відділу камери в інший. Тривалість подачі запахового сигналу складає, наприклад, 10-15 секунд, а інтервал між подачами варіюють в межах 1-2 хвилин (щоб забезпечити вентиляцію камери від запаху і уникнути вироблення умовного рефлексу на сталий проміжок часу). При необхідності продовжують тестування з відповідно зменшеними концентраціями сумішей в запахових ємностях (Є2-Є5) до визначення мінімальної ефективної концентрації, яка і є показником (порогом) нюхової чутливості даної тварини до даної речовини Джерела інформації 1. Amoore J.E. Odor standards in, squeeze bottle kids for matching quality and intensity // Wat. Sci. Tech. V. 25, P. 1-9, 1992. 2. Doty R.L., Shaman P., Dann M. Development of the University of Pensylvania Smell Identification Test, a standardized microencapsulated test of olfactory function // Physiol. Behav. V. 32, P. 489-502, 1984. 3. Sunberg H., Doving K., Novikov S., Ursin H. A method for studying responses and habituation to odor in rats // Behav. Neur. Biol. V. 34, № 1, P. 1 1 3 119,1982. 4. Marques D.M., O'Conne! R.J., Benimoff N.. Macrides F. Delayed deficit in behavior after transsection of the olfactory tracts in hamster // Physiol. Behav. V. 28. № 2, P. 353-365, 1982. 5 Малюкина Г.А., Марусов Е.А. Изучение обоняния рыб с помощью метода электрокардиографии // Вопросы ихтиологии, Т. 11, № 6,0.1088-1097. 6. Макарчук Н.Е., Ганжа Б.Л. Вегетативные компоненты оборонительного рефлекса после периферической деолфактации у крыс //Пробл. физиол. гигюталамуса. Вып. 24, С. 91-96, 1990. 7. Макарчук М.Ю., Ритікова Л.С. Поведінкове тестування змін нюхової чутливості у щурів після периферичної деолфактації та олфактобульбектомії // Вісник Київського університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. Вип. 2, С. 1 1 9 128, 1996. 6. Beauchamp G.K., Katahira K., Yamazaki К. et al. Evidence suggesting that the odorotypes of pregnant women are a compound of maternal and fetal odortypes // Proc. Ndl. Acad. Sci. USA Medical Sciences. V. 92, P. 2617-2621, 1995. 9. Ache B.W., Gleeson R.A. An approach to the focal presentation of chemical stimuli // Chemical Senses. V. 6. № 3, P. 225-230, 1982. 34911 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» • Україна. 88000, м Ужгород, вул Гагаріна. 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03