Спосіб визначення індивідуальної чутливості пацієнтів до нестероїдних протизапальних препаратів

Спосіб визначення індивідуальної чутливості пацієнтів до нестероїдних протизапальних препаратів шляхом дослідження крові, що відрізняється тим, що виділяють суспензію моноцитів, стимулюють в них метаболізм арахідонової кислоти, потім моноцити додатково інкубують Із кожним досліджуваним нестерощним протизапальним препаратом, у мазках моноцитів із кожної проби підраховують середню кількість ліпідних гранул в одній клітині і за максимальним розміром цього показника визначають несгерощний протизапальний препарат, до якого є найбільша чутливість пацієнта. Спосіб, що заявляється - спосіб визначення індивідуальної чутливості пацігчтів до иестероїдних протизапальних препаратів належить до галузі медицини, зокрема, переважно, до ревматології та дерматології, призначений для спрямованого пошуку найбільш ефективного лікувального препарату на ізольованих клітинах крові в умовах поліклініки або стаціонару. Відомим способом комплексної оцінки індивідуальної чутливості пацієнтів до нестероїдних протизапальних препаратів (НПЗП) є спосіб f1. Ревматические болезни: Руководство для врачей / Под ред В.А. Насоновой и Н.В. Бунчука.- М.: Медицина, 1997. - 520 с ] , в основу якого покладена динаміка показників, що характеризують функціональну активність локомоторного апарата. При повній відсутності ефекту від застосування обраного НПЗП, що призначається в повній терапевтичній дозі протягом 3-4 днів, рекомендується замінити його іншим НПЗП і, таким чином, підібрати найбільш ефективний препарат. Недолік відомого способу полягає є тому, що за своєю сутністю експериментальне дослідження здійснюється безпосередньо на пацієнті, органи і функціональні системи якого залучені до патологічного процесу, з усіма негативними наслідками дії препарату, що випливають із цього, аж до розвитку алергічної реакції у випадку нестерпності пацієнта до НПЗП, що використовується. Під час повторного призначення пацієнту нового НПЗП буде потрібна об'єктивізація ефекту післядії пре парату, що застосований раніше. Недоліками способу, що описаний, є також складність (багатоетапність) і тривалість процесу визначення найбільш ефективного НПЗП. Найбільш близьким за технічною сутністю до способу, що заявляється, € спосіб визначення індивідуальної чутливості пацієнтів до нестероїдних протизапальних препаратів [2. Чучалин А. Г., Апульцина И.Д. Способ определения непереносимости к нестероидным препаратам I Авторское свидетельство СССР № 833209. - М. Kn. A 61 В 10/00- Бюп. N» 20,1981J, що складається з дослідження крові, для чого плазму крові пацієнта інкубують протягом 20-40 хв. із рівними кількостями досліджуваного нестероїдного протизапального препарату і фізіологічного розчину при 1-15-38Х, визначають рівень ПГГ-га і ПГЕг. при підвищенні якого в порівнянні з вихідним рівнем визначають нестерпність до нестероїдних протизапальних препаратів Відомий спосіб базується на факті інгибування нестероїдним протизапальним препаратом цикгюоксигенази - ключового ферменту, що забезпечує перетворення арахідонової кислоти в циклічні ендоперекиси, і має ряд обмежень, пов'язаних із реалізацією його дій і точністю вимірів динаміки рівня простагландинів у крові. По-перше, венозна кров являє собою гетерогенну групу клітин (еритроцити, лейкоцити і тромбоцити), що відрізняються вихідним рівнем активності циклооксигенази І чутливістю рецепторів до синтезованих простат є» о CM со де со 35320 ландинів; по-друге, інкубація клітин крові з різними НПЗП може не змінити істотно активність циклооксигенази; по-третє, радіоімунний метод дослідження вмісту простагландинів є дорогим і «примхливим» (залежить від часу й умов збереження зразка крові, ступеня гемоліза, утримання вивірки тощо). Тому аналіз сумарного ефекту, що реєструється, якщо судити за динамікою вмісту простагландинів, визначених радіоімунним методом у плазмі крові, є реакцією різних клітин крові на різноманітні НПЗП і буде ускладнюватися значною похибкою вимірів, тому може виявитися малоінформативним для оцінки індивідуальної чутливості пацієнтів до НПЗП. Так, за нашими даними, можливість оцінки індивідуальної чутливості пацієнтів до НПЗП, завдяки описаному вище способові, не перевищує 25%. В основу винаходу, що заявляється, поставлена задача визначення індивідуальної чутливості пацієнтів до нестероїдних протизапальних препаратів шляхом дослідження крові, для чого виділяють суспензію моноцитів, стимулюють в них метаболізм арахідонової кислоти, потім моноцити додатково інкубують із кожним досліджуваним нестероїдним протизапальним препаратом, у мазках моноцитів із кожної проби підраховують середню кількість ліпідних гранул в одній клітині і за максимальним розміром цього показника визначають нестероїдний протизапальний препарат, до якого є найбільша чутливість пацієнта, що дає можливість істотно підвищити точність способу. Сутність способу, що заявляється, складається з дослідження крові, для чого виділяють суспензію моноцитів, стимулюють в них метаболізм арахідонової кислоти, потім моноцити додатково інкубують з кожним досліджуваним нестероїдним протизапальним препаратом, у мазках моноцитів із кожної проби підраховують середню кількість ліпідних гранул в одній клітині і за максимальним розміром цього показника визначають нестероїдний протизапальний препарат, до якого є найбільша чутливість пацієнта. Новим у способі, що заявпяється, є те, що виділяють суспензію моноцитів, стимулюють в них метаболізм арахідонової кислоти, потім моноцити додатково інкубують із кожним досліджуваним нестероідним протизапальним препаратом, у мазках моноцитів із кожної проби підраховують середню кількість ліпідних гранул в одній клітині і за максимальним розміром цього показника визначають нестероїдний протизапальний препарат, до якого є найбільша чутливість пацієнта. Розробка способу, що заявляється, стала можливою завдяки вперше встановленим авторами таким науковим фактам По-перше, суспензія моноцитів є стабільним джерелом синтезу простагландинів, рівень яких чітко реєструється під час стимуляції внутрішньоклітинного метаболізму арахідонової кислоти, наприклад, карбохоліном, що підвищує активність фосфоліпази А г (табл. 1). Відомо, що основними джерелами субстрату для біосинтезу простаноїдів в організмі є фосфоліпіди клітинних мембран, тригліцериди та етерифіційований холестерин, які в результаті дії фосфоліпази А г визволяють вільні поліненасичені жирні кислоти. Останні виявляються в цитоплазмі моноцитів у виді ліпідних крапель під час цитохімгч ного дослідження з застосуванням тетраоксида осмія та а-нафтипаміна (виявлення ненасичених ліпідів за методом Адамса). У світлі цього різноспрямований характер динаміки рівня ПГЕг у моноцитах і утримання в їхній цитоплазмі ліпідних крапель (попередників простаноїдів) в умовах стимуляції фосфоліпази Аг карбохоліном, а також високий коефіцієнт кореляції між цими двома показниками (г - - 0.758) дозволяє визнати кількість ліпідних крапель в якості об'єктивного морфологічного критерію активності метаболізму арахідонової кислоти. По-друге, інкубація моноцитів хворого на псоріатичний артрит (ПА) in vitro із різними НПЗП при базальному (не стимульованому) метаболізмі арахідонової кислоти характеризується подібним інгибуючим ефектом, що знаходить вираження в статистично недостовірних розходженнях вмісту ліпідних гранул у цих лейкоцитах (табл. 2). Різниця чітко виявляється під час стимуляції активності фосфоліпази Аг. Таким чином, достовірні розходження ступеня інгибування активності циклооксигенази (ключового ферменту синтезу простагландинів) нестероїдними протизапальними препаратами виявляються тільки в умовах активації метаболізму арахідонової кислоти, що дозволяє підвищити точність оцінки чутливості пацієнта до застосованих препаратів У той же час використання ізольованих клітин дозволяє уникнути виникнення у пацієнтів побічних реакцій, що пов'язані з застосуванням нестероїдних протизапальних препаратів. Технічна простота запропонованого способу дозволяє багаторазово досліджувати ефективність лікування пацієнта. Досягнення технічного результату даного способу засновано на оцінці середнього цитохімічного коефіцієнта вмісту ліпідних гранул у цитоплазмі моноцитів після інкубації клітин із ізадрином і одним із запропонованих для лікування нестероїдних протизапальних препаратів. Наші дослідження показали, що якщо оцінювати індивідуальну чутливість пацієнта до нестероїдних протизапальних препаратів за середнім цитохімічним коефіцієнтом вмісту ліпідних гранул у моноцитах, то точність збігу результатів, що отримані in vitro, і клініко-ла* бораторними даними обстеження пацієнта підвищується до 7 0 % і, тим самим, дозволяє індивідуалізувати терапію. Реалізують спосіб таким чином: У хворого беруть венозну кров, з якої виділяють суспензію моноцитів, наприклад концентруванням клітин у інтерфазі. що включає фікопверографин (щільність 1,077). Моноцити суслензують у повному живильному середовищі (ПЖС) до концентрації 106клітин у 1 мол. Суспензію моноцитів переносять до круглодонного 96-ти лункового планшету: число клітин на лунку складає 1 х х 10 s . У 1-й серії тестів у лунки з клітинами додають 0.1 мл фізіологічного розчину (1-й контроль), у 2-й серії в лунки вводять по 0,1 мл карбохоліна, кінцева концентрація якого в пробі складає 1 0 * ммоль/л. Проби інкубують при t=37°C протягом 10 хе. Після цього до моноцитів додають один із нестероїдних протизапальних препаратів, що рекомендуються (наприклад, аспірин, індо 35320 метацин, мотрин, напроксен, моваліс, диклофенак, піроксикам), кінцева концентрація якого в пробі відповідає стандартній добовій дозі. Проби інкубують при t = 20°С протягом 10 хв. Після цього готують мазки і виявляють внутрішньоклітинні ненасичені ліпіди за методом Адамса із застосуванням тетраоксида осмія та а-нафтиламіна. Під час мікроскопи мазків підраховують кількість моноцитів із визначеним числом ліпідних фанул і розраховують середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК), наприклад, використовуючи метод Kaplow L.S. (1955). Показником високої індивідуальної чутливості пацієнта до нестероїдного протизапального препарату є максимальне значення середнього цитохімічного коефіцієнта дослідної проби (інкубація моноцитів із карбохоліном + один із досліджуваних нестероїдних протизапальних препаратів) Рекомендується призначати пацієнту препарат, що у тесті з активацією метаболізму арахідонової кислоти карбохоліном in vitro викликає максимальне підвищення кількості ліпідних гранул у цитоплазмі і, отже, значення різниці між контрольною (без інкубації) і даною дослідною пробою буде найменшим. Наводимо конкретні приклади реалізації способу визначення індивідуальної чутливості пацієнта до нестероїдних протизапальних препаратів, що заявляється. Приклад 1. Хворий Н , 35 років, страждає на псоріатичну артропатію, що поєднується зі шкірними проявами захворювання. Клінічно, суглобовий синдром характеризувався артралгіями, тугорухомістю (переважно в ранковий час), набряклістю області суглобів. До призначення медикаментозної терапії зроблено визначення чутливості пацієнта до нестерощних протизапальних препаратів за результатами інкубації моноцитів із карбохоліном, а також аспірином, індометацином, мотрином, нэп* роксеном, мовалісом, диклофенаком і піроксикамом. Середній цитохімічний коефіцієнті вмісту ліпідних гранул у моноцитах без інкубації (контроль) склав 2,98, а після інкубації з карбохоліном - 1,26; під час інкубації дослідних проб отримані значення СЦК відповідно склали для аспірину 2,74, індометацина 1,77; мотрина 1,38; напроксена 1.64; моваліса 2,31; диклофенака 2,25 і піроксикама 2,62. Таким чином, максимальний розмір СЦК вмісту ліпідних фанул в дослідних пробах мав місце під час інкубації моноцитів з аспірином і досягав 2,74. Результати тестування in vitro чутливості пацієнта до нестероїдних протизапальних препаратів дозволили рекомендувати для курсового лікування аспірин. Двотижневе призначення аспірину збільшило середній цитохімічний коефіцієнт вмісту ліпідних фанул у моноцитах пацієнта до 3,31. Відповідно за даними клініко-лабораторного обстеження визначено розрішення псоріатичних висипань (зменшення лущення, еритеми, зппющення окремих папул). Спостерігалася позитивна динаміка суглобового синдрому, що виявлялося значним зменшенням артралгій, збільшенням обсягу рухів в уражених суглобах. Це дає підставу визнати ефективним призначення аспірину, а виходить, і високу точність запропонованого способу визначення індивідуальної чутливості пацієнта до нестерощних протизапальних препаратів. Приклад 2. Хвора 3., 46 років, надійшла до відділення з діагнозом - професивна стадія псоріазу. Патологічний процес на шкірі носив поширений характер- на волосистій частині голови, обличчі, тулубові, кінцівках була велика кількість різних за розмірами ексудативних бляшок. Мав місце активний поліартрит, ранкова скутість досягала 370 хв., індекс Річі - 22, число уражених суглобів - 20, біль (за візуальною 10-сантиметровою шкалою) оцінювалася на 6,2. До призначення медикаментозної терапії зроблено визначення чутливості пацієнтки до нестероїдних протизапальних препаратів за результатами інкубації моноцитів із карбохоліном. а також аспірином, індометацином. мотрином, напроксеном, мовалісом, диклофенаком і піроксикамом. Середній цитохімічний коефіцієнт вмісту ліпідних фанул у моноцитах без інкубації (контроль) склав 3,16, після інкубації тільки з карбохоліном склав 1,21; а після інкубації дослідних проб відповідно для аспірину 2,61, індометацина 2,01; мотрийа 1,33; напроксена 1,79; моваліса 2,85; диклофенака 3.07 і піроксикама 2,30 Таким чином, максимальний СЦК вмісту ліпідних гранул серед дослідних проб має місце під час. інкубації моноцитів із диклофенаком (3,07). Двотижневе призначення диклофенака збільшило СЦК вмісту ліпідних фануп у моноцитах пацієнта до 3,51 Через два тижні після початку лікування відзначалося зменшення лущення і сверблячки, припинення свіжих висипань Відзначена також позитивна динаміка показників активності суглобового синдрому (зменшення фивалості ранкової скутості до 260 хв . індексу Річі - до 14, числа уражених суглобів - до 10 і болі - до 3.5 за візуальною 10сантиметровою шкалою) Дані морфологічного дослідження біопсії шкіри підтвердили ефективність проведеної терапії. Таким чином, призначення диклофенака можна визнати ефективним. Використання способу визначення індивідуальної чутливості пацієнтів до нестероїдних протизапальних препаратів, що заявляється, дає можливість індивідуалізувати лікувальну тактику. Перевага способу, що заявляється, складається в тому, що він технічно простий, економічний, інформативний, скорочує час і матеріальні витрати на проведення досліджень, підвищує достовірність вибору найбільш адекватного нестероїдного протизапального препарату й ефективність проведеної терапії Перераховані переваги визначають перспективність застосування методу в ревматології та дерматології для індивідуалізації терапії хворих, що страждають на артрити. Спосіб дозволяє також визначити найбільш ефективний нестероїдний протизапальний препарат без його введення до організму, що дозволяє уникнути побічних реакцій у пацієнтів. Іспити способу, що заявляється, проведені на 25-ти пацієнтах, що страждають на псоріаз і псоріатичний артрит. Джерела інформації, що прийняті до уваги 1. Ревматические болезни: Руководство для врачей / Под. ред. В.А. Насоновой и Н.В. Бунчука.- М.: Медицина. 1997. - 520 с. 2. Чучалин А. Г., Апульцина ИД. Способ определения непереносимости к нестероидным препаратам / Авторское свидетельство СССР Ne 833209. -М. Кл. А 61 В 10/00.- Бюл № 20. 1981. 35320 Вплив стимуляції фосфоліпази А? моноцитів хворих на псоріаз у тесті in vitro на вміст метаболітів арахідонової кислоти (п=11) Показник Таблиця 1 Вихідний рівень Інкубація з карбохоліном (100 мк) на 1 клітину 3,94±0,21 1,18±0,17" ПГЕ2 (нг/106 клітин) 9,25±0,48 12,37±0.32 •* Середня кількість ліпідних гранул Примітка: " - р 2,97 Кх + Мотрин, 200 1,30 Кх + Налроксен, 170 2,64 Кх • Моваліс. ЗО 3,05 Кх + Диклофенак. 160 2.43 Кх + Піроксикам, 20 1.94 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна. 88000. м, Ужгород, вуп. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3