Спосіб індивідуальної оцінки порушень окислювального гомеостазу організму

Спосіб індивідуальної оцінки порушень окислювального гомеостазу організму, який полягає у біохімічному визначенні показників перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та показників антиоксида 34257 трієва сіль) в кінцевій концентрації 1 мМоль/мл 0,5 мл крові. Потім екстрагували в 5 мл суміші гептанізопропанолу (1:1) за об'ємом. При цьому суміш струшують в закритих пробірках протягом 15 хв. Після центрифугування при 10000 об./хв, зливають ліпідні екстракти і розводять у 5 мл суміші гептан-ізопропанол (3:7) за об'ємом. Додають до розбавлених ліпідних витяжок водний розчин хлористоводневої кислоти рН=2 в об'ємі 2 мл для розподілу фаз і відмивки від неліпідних сумішей. Після розділу нижню фазу відбирають в окрему суху пробірку, і до водно-спиртової фази додають 1г NаСІ, для зневоднення ізопропанольного екстракту. Оптичний контроль готують так, як і кров, але замість 0,5 мл крові беруть 0,5 мл 0,1 мМоль ЕДТА, розбавленого ізотонічним розчином натрію хлориду. Виміряють оптичну щільність кожної фази щодо контролю при довжинах хвиль 220 нм, 232 нм, 278 нм. Вміст проміжних продуктів ПОЛ в 1 мл крові визначають за формулою: Е/мл крові= становить 0,15-0,25 мг/мл. Концентрацію гемоглобіну визначають за будь-яким стандартним лабораторним методом. До 2 мл розчину (беруть 0,1 мл еритроцитів, додають 1,9 мл розчину ЕДТА, додають до 0,04 мл попереднього розчину 4 мл дистильованої води) додають 0,4 мл хлороформу та 0,2 мл етанолу, енергійно струшують, центрифугують упродовж 10 хв при 4000 об./хв. Отриманий екстракт використовують для проведення реакції. Перед роботою отриманий екстракт розводять водою у співвідношенні 1:10. У дві пробірки (дослід, контроль) наливають по 0,1 мл екстракту, 0,9 мл дистильованої води, 1 мл 0,03% Н2О2. У контрольну пробу додають 2 мл 4% молібдату амонію, витримують упродовж 10 хв, а в дослідну пробу додають 2 мл молібдату амонію без інкубації. Вимірюють інтенсивність забарвлення на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм. Для розрахунку активності каталази будують калібровочний графік для визначення концентрації Н2О2 в діапазоні концентрацій від 0 до 0,5 мкМ, та визначають оптичне поглинання 1 мМ розчину Н2О2 (мкМоль/мг Нb/мин). Активність розраховують за формулою: E ´6 = E × 12 0 ,5 де Е - показник екстинкції; 6 - об'єм крові; 0,5 - кількість крові. Недоліком відомого способу є неспроможність оцінити в усьому обсязі ступінь порушення стану перекисного окислення ліпідів. Біохімічне визначення кінцевого продукту ПОЛ - малонового діальдегіду здійснюють наступним способом (див.: Гаврилов В.П., Гаврилова А.Р., Матуль М.Н., 1987): додають до 0,2 мл сироватки крові (у контролі 0,2 Н2О) 2 мл 1 % Н3РО4 і 0,6 мл 1% ТБК і витримують впродовж 45 хв на водяній бані при 100°С і охолоджують. Визначення проводять на спектрофотометрі при довжині хвилі 532 нм та 580 нм щодо контрольної проби. Вміст ТБК-активних продуктів (малоновий діальдегід) проводять згідно з формулою: E= DE ´ 1000 ´ 2 ´ 1,1 ´ 10 A ´ [Hb]´ 10 де DЕ =(Ек-Еg) - оптичне поглинання контрольної та експериментальної проб; 1000-коефіцієнт перерахунку в мкМ Н2О2; 2; 1,1; 10 - коефіцієнти розведення проби; А - оптичне поглинання 1 мМ розчину Н2О2 (2200 мМоль -1 см-1); [Нb] - кількість гемоглобіну в пробі; 10 хв - термін інкубації при 22°С. Для визначення активності ферменту супероксиддисмутази в еритроцитах гемолізат готують таким самим способом, як і для визначення каталази (див.: Міsra Н.Р., Fridovich І., 1972). Вимірюють вміст гемоглобіну. Для реакції беруть 2,0 мл гемолізату, 0,4 мл хлороформу, 0,2 мл етанолу, енергійно струшують. Центрифугують упродовж 10 хв при 4000 об./хв. Отриманий екстракт використовують для реакції. У дослідну пробірку поміщають 0,5 мл центрифугату, в контрольну - 0,5 мл дистильованої води. В обидві пробірки додають 0,5 мл карбонатного буфера (рН=10,2) та 0,1 мл адреналіну. Вимірюють кінетику ферментативної реакції на спектрофотометрі при довжині хвилі 340 нм та температурі 30°С упродовж 5 хв. Для розрахунку беруть дані між третьою та четвертою хвилинами: DE ´ 106 ´ 2,8 нМоль / мл 1,56 ´ 105 ´ 0,2 де DЕ - різниця Е532 та Е580; 2,8 - об’єм проби; 1,56·105 - коефіцієнт молярної екстинції; 0,2 - кількість сироватки у пробі. Недоліком відомого способу є неспроможність оцінити в усьому обсязі ступінь порушення стану перекисного окислення ліпідів організм, що не дає змоги уявити патогенетичну картину розладу життєдіяльності організму. Відомий біохімічний спосіб визначення показників антиоксидантної системи організму (ферментів каталази, супероксиддисмутази, глутатіопероксидази, глутатіоредуктази, вмісту відновленого глутатіону, інтегрального показника - фактору антиоксидантного стану) (див.: Каролюк М.А., Иванов Л.А., Майорова И.Г., 1988), який полягає в тому, що для визначення активності ферменту каталази додають до 0,1 мл еритроцитів 1,9 мл стабілізуючого розчину ЕДТА, додають до 0,04 мл попереднього розчину 4 мл дистильованої води та визначають вміст гемоглобіну: до 2 мл цього розчину додають 2 мл LN НСL, розбавленого ізотонічним розчином натрію хлориду. Виміри проводять на спектрофотометрі при довжині хвилі 530 нм. Оптимальна концентрація гемоглобіну в екстракті Ак-Аg=A T%= E= T% 100 - T % E ´ 2 ´ 1,1 A од / мг[Нb ] ´ 100% K= Нb Ak де Aк - екстинція контрольної проби; А - екстинція дослідної проби; Т% - відсоток; Е - % інгібування; Нb - кількість гемоглобіну в пробі; К - активність СОД в од/мг Нb; 2 - мл гемолізату в пробі (розводили 1:1000). Для визначення активності ферменту глутатіонпероксидази використовують гемолізат еритроцитів при розведенні дистильваною водою (1:40) (див.: Власова С.Н., Шабунина Е.Ш., Переслегина И.А., 1990). 2 34257 (активність каталази )´ (активність CОО ) Для того, щоб почалась реакція до інкубаційної суміші (1 мл фосфатного буфера (0,3 М рН=7,4 з 12 мМ азидом натрію та 6 мМ ЕДТА); 0,5 мл глутатіона відновленого; 0,2 мл гемолізату; 0,5 мл перекису водню) додають перекис водню і зупиняють через 2 хв 1 мл трихлороцтової кислоти. В контрольній пробі гемолізат замінюють 0,2 мл дистильованої води. Пробірки центрифугують впродовж 15 хв при 3000 об./хв. Прозору рідину, яка утворилася над осадом, зливають і проводять виміри на спектрофотометрі при довжині хвилі 260 нм щодо контролю. Активність ферменту розраховують за формулою: ФакторАОС = мк Моль/мгHb од/мгHb концентрац малонового діальдегід ія у нМоль/мл Недоліком цих засобів є неможливість достовірно визначити індивідуальний тип порушень окислювального гомеостазу організму та вибрати антиоксидантні препарати необхідні для корекції саме цього типу порушень. Технічною задачею заявлюваного винаходу є створення достовірного і доступного способу індивідуальної оцінки порушень окислювального гомеостазу організму для індивідуального визначення типу порушень та визначення комплексу адекватних антиоксидантних препаратів для кожного типу. Поставлена технічна задача вирішується за рахунок того, що проводять біохімічне визначення показників перекисного окислення ліпідів та показників антиоксидантної системи організму, причому визначають на основі отриманих чисельних даних співвідношення показників ПОЛ та АОС до нормальних величин у відсотках, будують графічні векторограми порушень окислювального гомеостазу та визначають індивідуальний тип порушень: 1 ступінь тяжкості - при вираженому зсуві векторограми догори вправо та вниз, 2 ступінь тяжкості при незначному зсуві догори вправо та значному зсуві донизу вправо, 3 ступінь тяжкості - при вираженому зсуві догори вліво та донизу вправо, 4 ступінь тяжкості - при вираженому зсуві догори вправо та вниз вправо, 5 ступінь тяжкості - при вираженому зсуві догори та вниз. Перевагою цього способу є можливість мати індивідуальну повну картину порушень окислювального гомеостазу у пацієнта та забезпечити патогенетичне обгрунтоване призначення адекватного набору антиоксидантних препаратів. Конкретні приклади використання способу Хворий Я., 52 років, показники ПОЛ - первинні - 4,92, кінцевий - 3,43. Показники АОС -ферменти: каталаза - 1863, супероксиддисмутаза - 3,85, глютатіонредуктаза - 521, глутатіонпероксидаза - 173, глутатіонвідновлений - 1163 антиоксидантний фактор - 2091. Визначаємо процентне відношення показників ПОЛ та АОС до контрольних величин: продукти ПОЛ первинні 291%, кінцевий 94%, показники АОС - каталаза 102%, супероксид-дисмутаза 79%, глютатіонредуктаза 70%, глютатіонпероксидаза 114%, глютатіон відновлений 192%, антиоксидантний фактор 86%. Будуємо векторограму. DE ´ A ( мМоль / гемоглобіну ´ хв Б´В де DЕ - показник екстинції; А - об'єм інкубації проби; Б - коефіцієнт молярної екстинції глутатіону окисленого; В - кількість гемоглобіну. Для визначення активності ферменту глутатіонредуктази використовують гемолізат еритроцитів (див.: Власова С.Н., Шабунина Е.Ш., Переслегина И.А., 1990). До складу інкубаційної суміші входить 2 мл фосфатного буфера; 0,2 мл ЕДТА; 0,5 мл розчину окисленого глутатіону; 0,2 мл гемолізату; 0,1 мл розчину НАДФН відновленого. В контрольній пробі гемолізат замінюють дистильованою водою. Проводять вимірювання при температурі 37°С впродовж 10 хв щодо контрольної проби при довжині хвилі 340 нм через кожну 1 хв. Активність ферменту розраховують за формулою: DE ´ 3 (мкМоль НАДФН/г гемоглобіну·хв) 6,22 ´ A де DЕ - різниця оптичної щільності за 1 хв; 3 - об'єм інкубації суміші; 6,22 - коефіцієнт молярної екстинції НАДФН відновленого; А - кількість гемоглобіну. Для визначення вмісту відновленого глутатіону беруть 0,1 мл крові розведеної в 0,5 мл 10мМ НСL (пробірки пластикові) (див.: Аnderson М.Е., 1983). Тричі заморожують-розморожують. Потім пробірки центрифугують упродовж 5 хв при 10000 g на рефрижераторній центрифузі. До супернатанту додають 250 мкл 10% розчину 5сульфосаліцилової кислоти, струшують, і знову центрифугують за тих самих умов. Після цього 0,1 мл супернатанту (у контрольну пробу додають 0,1 мл дистильованої води) додають в пробірку, в якій знаходиться інкубаційна суміш: 0,2 мл фосфатного буфера; 0,2 мл ДТНБ; 0,3 мл дистильованої води. Ставлять на водяну баню і витримують упродовж 10 хв при температурі 30°С. Виміри проводять щодо контролю при довжині хвилі 412 нм. Показник екстинкції перемножується на коефіцієнт 12500 і виражаємо в мкМоль відновленого глутатіону на 1 л крові. Для визначення фактору антиоксидантного стану організму (фактор АОС) (див.: Чевари С., Андял М., Штенгер Я., 1991) використовують наступну формулу: Векторограма (І) 3 34257 Векторограма характеризується вираженим зсувом догори вправо та вниз, що свідчить про значне накопичення первинних ПОЛ. Визначено 1 ступінь тяжкості. Призначено: антиоксидантні препарати, що нормалізують продукти ПОЛ та підвищують активність ферментів антиоксидантної системи апіфітопродукти - Флора-7, або Мілісан-3. Через два тижні контрольні лабораторніі дослідження показали що зміст первинних та кінцевих продуктів ПОЛ зменшився, а активність каталази та супероксиддисмутази підвищилась до рівня контрольних показників. Хворий М., 53 років, показники ПОЛ - первинні - 2,52, кінцевий - 4,69. Показники АОС ферменти: каталаза - 1790, супероксиддисмутаза - 5,30, глютатіонредуктаза - 563, глутатіонпероксидаза - 257, глутатіонвідновлений - 238 антиоксидантний фактор - 2023. Визначаємо процентне відношення показників ПОЛ та АОС до контрольних величин: продукти ПОЛ первинні 149%, кінцевий 128%, показники АОС - каталаза 98%, супероксид-дисмутаза 109%, глютатіонредуктаза 75%, глюта-тіонпероксидаза 169%, глютатіон відновлений 39%, антиоксидантний фактор 83%. Будуємо векторограму. Векторограма (ІІІ) Векторограма характеризується вираженим зсувом догори вліво та донизу вправо, що свідчить про накопичення кінцевих продуктів ПОЛ, підвищення активності супероксиддисмутази на фоні пригнічення активності каталази (дисбаланс ферментів антиоксидантного захисту), значне підвищення активності глутатіонпероксидази на фоні нормальних величин глутатіонредуктази та глутатіону відновленного Визначено - 3 ступінь тяжкості. Призначено: антиоксидантні препарати, що нормалізують продукти ПОЛ та підвищують активність ферменту каталази - Флора-7 або Мілісан-3, та комплекс вітамінів А, Е, С – препарат Веторон. Через два тижні контрольні лабораторні дослідження показали що зміст первинних та кінцевих продуктів ПОЛ зменшився, а активність каталази підвищилась до рівня контрольних показників. Хворий Б., 42 років, показники ПОЛ - первинні 2,82, кінцевий - 5,77. Показники АОС - ферменти: каталаза - 1275, супероксиддисмутаза - 2,50, глютатіонредуктаза - 725, глутатіонпероксидаза 160, глутатіонвідновлений - 275 антиоксидантний фактор - 552. Визначаємо процентне відношення показників ПОЛ та АОС до контрольних величин: продукти ПОЛ первинні 167%, кінцевий 158%, показники АОС - каталаза 70%, супероксиддисмутаза 51%, глютатіонредуктаза 97%, глютатіонпероксидаза 105%, глютатіон відновлений 45%, антиоксидантний фактор 23%. Будуємо векторограму. Векторограма (ІІ) Векторограма характеризується незначним зсувом до гори вправо та значним зсувом до низу вправо, що свідчить про деяке накопичення первинних та кінцевих продуктів ПОЛ, про дисбаланс глутіонової системи (підвищення активності глутатіонпероксидази при зменшенні активності глутатіонредуктази на фоні значного зменшення вмісту глутатіону відновленного). Визначено -2 ступінь тяжкості. Призначено: антиоксидантні препарати, що нормалізують продукти ПОЛ та підвищують активність ферментів глутатіонової системи – гідролізат з мідій - Моревіт. Через два тижні контрольні лабораторні дослідження показали що вміст первинних та кінцевих продуктів ПОЛ зменшився, а показники глутатіонової системи були на рівні контрольних. Хворий Т., 49 років, показники ПОЛ – первинні - 2,18, кінцевий - 7,12. Показники АОС ферменти: каталаза - 1287, супероксиддисмутаза - 8,80, глютатіонредуктаза - 699, глутатіонпероксидаза - 293, глутатіонвідновлений - 562 антиоксидантний фактор -1591. Визначаємо процентне відношення показників ПОЛ та АОС до контрольних величин: продукти ПОЛ первинні 129%, кінцевий 195%, показники АОС - каталаза 71%, супероксиддисмутаза 181%, глютатіонредуктаза 94%, глютатіонпероксидаза 193%, глютатіон відновлений 93%, антиоксидантний фактор 66%. Будуємо векторограму. Векторограма (IV) Векторограма характеризується вираженим зсувом догори та вправо та вниз вправо, що свідчить про накопичення первинних та кінцевих продуктів ПОЛ, виснаження антиоксидантних резервів. Визначено - 4 ступінь тяжкості. Призначено, антиоксидантні препарати, що нормалізують продукти ПОЛ та підвищують активність ферментів антиоксидантної системи - апіфітопродукти - Флора-7 або Мілісан-3. Через два тижні контрольні лабораторні дослідження показали що зміст первинних та кінцевих продуктів ПОЛ зменшився, а активність 4 34257 каталази та супероксиддисмутази підвищилась до рівня контрольних показників, величина антиоксидантного фактору підвищилась. Хворий Ч., 45 років, показники ПОЛ - первинні - 2,11, кінцевий - 7,67. Показники АОС - ферменти: каталаза - 1831, супероксиддисмутаза 3,64, глютатіонредуктаза - 694, глутатіонпероксидаза - 225, глутатіонвідновлений - 788 антиоксидантний фактор - 869. Визначаємо процентне відношення показників ПОЛ та АОС до контрольних величин: продукти ПОЛ первинні 125%, кінцевий 210%, показники АОС - каталаза 101%, супероксиддисмутаза 75%, глютатіонредуктаза 93%, глютатіонпероксидаза 148%, глютатіон відновлений 130%, антиоксидантний фактор 36%. Будуємо векторограму. Векторограма характеризується вираженим зсувом догори та вниз, що свідчить про накопичення кінцевого продукту ПОЛ, виснаження антиоксидантних резервів. Визначено -5 ступінь тяжкості. Призначено: антиоксидантні препарати, що нормалізують продукти ПОЛ та підвищують активність ферментів антиоксидантної системи - апіфітопродукти - Флора-7, Мілісан-3. Через два тижні контрольні лабораторні дослідження показали що зміст первинних та кінцевих продуктів ПОЛ зменшився, а активність каталази та супероксиддисмутази підвищилась до рівня контрольних показників, величина антиоксидантного фактору (АОФ) підвищилась. Спосіб може бути використаний в умовах лікарні, клініки та спеціалізованих відділеннях для індивідуальної оцінки порушень окислювального гомеостазу організму людини. Векторограма (V) __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5