Спосіб фарбування келихоподібних клітин кишечнику тварин і птиці

Спосіб фарбування келихоподібних клітин кишечнику тварин і птиці, який включає відбір, фіксацію та обробку досліджуваного матеріалу кишечнику з наступним виготовленням парафінових блоків, одержанням гістологічних зрізів, наклеюванням їх на предметні стекла, підсушування, депарафінізацію зрізів і доведення їх до води за стандартною схемою, фарбування препаратів 3 36488 препарату діалізованого заліза за Гале [Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М: Издательство иностранной литературы, 1962. - С. 757]. Для його реалізації рекомендуються нефіксовані свіжозаморожені зрізи та свіжозаморожені зрізи з їх подальшою швидкою фіксацією за Уолманом. Також можна використовувати парафінові зрізи на основі фіксатора Карнуа або формаліну). Зрізи слід прикріплювати до скла без застосування яких-небудь засобів для наклеювання. Далі зрізи доводять до води, видаливши при потребі осад ртуті. Заливають розчином діалізованого заліза (1 об'єм діалізованого заліза, 1 об'єм 2М оцтової кислоти) на 10 хвилин. Добре промивають дистильованою водою. Заливають підкисленим розчином фероціаніду калію (рівні об'єми 0,02 MK4[Fe(CN)66] і 0,14МHСl і залишають на 10 хвилин. Промивають у воді. Дофарбовують ядра галуновим карміном Маєра (6-18 годин) або 1% водним розчином нейтрального червоного (1 хвилина). При роботі із замороженими зрізами дофарбовування не рекомендується. Далі зневоднюють спиртом, просвітлюють в ксилолі і поміщають в дистрендібутилфталат-ксилол або відповідне синтетичне середовище. Результат методу: кислі мукополіцукориди зафарбовуються в синій, а ядра - в червоний колір. Недоліками способу є те, що: кращі результати отримуються при використанні заморожуючого мікротому, тобто спосіб вимагає додаткового обладнання; методика вимагає розчину діалізату заліза, який є складним у приготуванні; готові зафарбовані препарати потребують заключения лише у синтетичні середовища. Відомий також спосіб фарбування мукополіцукоридів келихоподібних клітин методом Шиффйодної кислоти за Мак-Манусом [Кононський А.И Гистохимия. - К: Вища школа, 1976. - 275c.]. Для реалізації даного способу зрізи, виготовлені різними способами, доводять до води, окислюють 0,5% водним розчином йодної кислоти (не довше 2-5 хвилин) і промивають у дистильованій воді. Далі обробляють реактивом Шиффа протягом 10-15 хвилин та промивають у проточній воді протягом 5-10 хвилин. Дофарбовують ядра целестиновим голубим та гемалауном Маєра. При потребі диференціюють в 1% солянокислому спирті, а потім ретельно промивають проточною водою. Після цього зневоднюють у спиртах, просвітлюють у ксилолі і поміщають у синтетичне середовище. Результат способу наступний: розташовані у келихоподібних клітинах білки, що містять вуглеводи, забарвлюються в різні відтінки пурпурночервоного кольору. Глікоген забарвлюється в темніший колір. Основними недоліками цього способу є такі: приготування фарбуючи х і допоміжних розчинів потребує значної кількості реактивів; спосіб вимагає дефіцитних реактивів (гемалуну Маєра та целестинового голубого), які є важкодоступними у мережі хімреактивів та потребують доставки з-за кордону; висока вартість йодної кислоти та синтетичних середовищ для заключення гістозрізів; громіздкість та складність приготування реактиву Шиффа, який швидко псується навіть при відпові 4 дних умовах зберігання; реактив Шиффа потребує спеціальних умов зберігання. Найбільш близьким за суттю до способу, що заявляється, є гістохімічне виявлення кислих мукополіцукоридів келихоподібних клітин альціановим синім за Стідменом [Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М: Издательство иностранной литературы, 1962. - С.759-760]. Для його реалізації використовують фіксований і нефіксований матеріал. Для парафінових зрізів рекомендується фіксація за Буеном і Карнуа, а також фіксація формаліном і сумішшю сулема-формалін. Парафінові зрізи наклеюють на предметне скло, висушують у термостаті для їх прикріплення до скла, депарафінізують і доводять до дистильованої води за стандартною схемою. Після цього препарати протягом 10-30 секунд зафарбовують у свіжовідфільтрованому 0,1% розчині альціанового синього в 3-процентній оцтовій кислоті та промивають у дистильованій воді. Далі зафарбовують гемалауном Ерліха протягом 5-10 хвилин, або 1% розчином нейтрального червоного протягом 30 секунд, або 0,5% хлорантіновим міцним червоним 5В протягом 10-15 хвилин. Диференціюють в 1% розчині спирту та промивають в проточній воді протягом 10-20 хвилин. При зафарбуванні нейтральним червоним або хлорантіновим міцним червоним диференціацію та промивання не проводять. Наступним етапом є зневоднення в спирті, просвітлення в ксилолі і поміщення в канадський бальзам або дистрен-дібутилфталат-ксилол. Якщо після фарбування альциановим синім проводиться фарбування в кислому розчині, то після промивки у дистильованій воді зрізи занурюють в 1%спиртовий розчин лугу (рН 8 або ви ще) не менше 2 годин для того, щоб перевести барвник в нерозчинний монастралевий міцний голубий. Результат методу: кислі мукополіцукориди - чистого синьо-зеленого кольору. Ядра - темно-сині, або темно-червоні. Заявлений спосіб і прототип мають спільні ознаки: спосіб включає відбір, фіксацію та обробку досліджуваного матеріалу кишечнику з наступним виготовленням парафінових блоків, одержанням гістологічних зрізів, наклеюванням їх на предметні скла, підсушування, депарафінізацію зрізів і доведення їх до води за стандартною схемою, фарбування препаратів зануренням у фарбуючий розчин, ретельне промивання у часто змінюваній воді, проведення через висхідний ряд спиртів, ксилол, заключения в бальзам та мікроскопічний аналіз гістопрепаратів. Недоліками способу є: 1. Висока вартість барвника альціанового синього. 2. Значна кількість використаних реактивів. 3. Певна складність реалізації методу. Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує швидке та ефективне фарбування келихоподібних клітин. Цей спосіб є нескладний у виконанні, не потребує додаткових фінансових витрат та значних затрат часу. Він не вимагає спеціального обладнання, інструментарію, великої кількості реактивів та спеціальної освіти. 5 36488 В основу корисної моделі покладено завдання розробити зручний, ефективний і не складний у практичному використанні спосіб фарбування келихоподібних клітин кишечнику тварин та птиці. Технічний результат досягається тим, що після доведення до води, препарати додатково висушують в термостаті при t=37°C протягом 24 годин і витримують у 6% розчині фосфорномолібденової кислоти протягом 10 хвилин, промивають 1 хвилину дистильованою водою і фарбують, занурюючи препарати у 0,1% водний розчин малахітового зеленого на 2 хвилини, промивають 1 хвилину дистильованою водою і фіксують забарвлення у 6% розчині фосфорномолібденової кислоти протягом 3 хвилин, при мікроскопічному дослідженні зафарбованих гістопрепаратів виявляють келихоподібні клітини, зафарбовані в інтенсивний яскраво-зелений колір. Поєднання витримування препаратів у розчині фосфорномолібденової кислоти, з фарбуванням малахітовим зеленим та фіксацією у фосфорномолібденовій кислоті, забезпечує зв'язування іонів молібдену з муцином келихоподібних клітин, який з розчином барвника малахітового зеленого утворює в середині цих клітин нерозчинний комплекс лак, нерозчинний в етиловому спирті та ксилолі. Повторне занурення у аналогічний розчин фосфорномолібденової кислоти протягом 3 хвилин забезпечує завершення процесу утворення нерозчинного лаку. В результаті, при мікроскопічному дослідженні зафарбованих гістопрепаратів, келихоподібні клітини кишечнику виявляються зафарбованими у інтенсивно зелений колір. При проведенні патентного пошуку заявником виявлено технічне рішення [Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М: Издательство иностранной литературы, 1962. - С.759-760], яке містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим рішенням: спосіб включає відбір, фіксацію та обробку досліджуваного матеріалу кишечнику з наступним виготовленням парафінових блоків, одержанням гістологічних зрізів, наклеюванням їх на предметні скла, підсушування, депарафінізацію зрізів і доведення їх до води за стандартною схемою, фарбування препаратів зануренням у фарбуючий розчин, ретельне промивання у часто змінюваній воді, проведення через висхідний ряд спиртів, ксилол, заключения в бальзам та мікроскопічний аналіз гістопрепаратів. Однак наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, є недостатньою для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які за сукупністю ознак повністю б співпадали із заявленим - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, у яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату тим, що після доведення до води, препарати додатково висушують в термо 6 статі при t=37°C протягом 24 годин і витримують у 6% розчині фосфорномолібденової кислоти протягом 10 хвилин, промивають 1 хвилину дистильованою водою і фарбують, занурюючи препарати у 0,1% водний розчин малахітового зеленого на 2 хвилини, промивають 1 хвилину дистильованою водою і фіксують забарвлення у 6% розчині фосфорномолібденової кислоти протягом 3 хвилин, при мікроскопічному дослідженні зафарбованих гістопрепаратів виявляють келихоподібні клітини, зафарбовані в інтенсивний яскраво-зелений колір. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) "винахідницький рівень". Заявлений спосіб належить до галузі біології, зокрема до техніки виготовлення плівкових та гістологічних препаратів кишечнику, а саме, способів фарбування плівкових та гістопрепаратів кишечнику для дослідження його структурнофункціонального стану. Корисна модель може бути використана в біологічних лабораторіях з різними формами власності, що проводять гістохімічні дослідження, а тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу (корисної моделі), відповідно до статті 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" №17712000p.-III. Реалізацію заявленого способу здійснюють наступним чином: фіксацію свіжого матеріалу кишкової трубки здійснюють у фіксаторах Карнуа (3 години), Буена (від 2 до 24 годин). Після використання фіксатора Буена матеріал промивали у проточній воді 24 години. Зафіксований матеріал проводили через висхідний ряд спиртів, починаючи з двох порцій 96° спирту по 1 добі в кожній порції. Далі у двох порціях абсолютного спирту по 1 добі в кожній порції. Після зневоднення матеріал на дві години переносили у суміш абсолютного спирту та бензолу (1:1), а потім у бензол перший та бензол другий на 1,5год в кожному. Критерієм просякання препарату бензолом є його просвітлення. Після цього препарати переносили у бензол-парафін 1:1 на 4 години (можна залишити і на ніч). Далі препарати просякали у двох послідовних порціях парафіну при 56°С протягом 1,5 години у кожній порції. З отриманих парафінових блоків готуються зрізи товщиною 5-7мкм та через воду наклеювалися на предметні скельця. Після висушування у термостаті і остаточного прикріплення препаратів до скла проводилася їх депарафінізація і доведення до дистильованої води за стандартною схемою. Після води скло з препаратом висушується 24 години при 37°С. Після цього скло зі зрізом занурюють на 10 хвилин у 6% фосфорномолібденову кислоту кваліфікації "хч". Далі промивають 1 хвилину у дистильованій воді і переносять у 0,1% водний розчин фарби малахітового зеленого на 2 хвилини. Зафарбований препарат фіксують у 6% розчині фосфорномолібденової кислоти протягом 3 хвилин. Промивають 2 хвилини у дистильованій 7 36488 воді, проводять через висхідний ряд спиртів, ксилол та поміщають у бальзам. При мікроскопічному досліджені одержаних препаратів спостерігають келихоподібні клітини, зафарбовані у інтенсивний яскраво-зелений колір. В умовах бойні було відібрано зразки кишкової трубки від свиней великої білої породи, корів чорно-рябої породи та овець української гірськокарпатської породи, які відразу фіксувалися у фіксаторі Буена, Карнуа. Аналогічні маніпуляції було проведено в умовах пта хофабрики зі зразками кишкової стінки різних відділів кишечнику курей кросу Іза-Браун. 8 В умовах лабораторії кафедри анатомії сільськогосподарських тварин Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького отримані зразки були залиті у парафінові блоки, з яких на санному мікротомі виготовлялися гістозрізи і наклеювалися на предметне скло. Одна половина отриманих зрізів була зафарбована вже відомим способом (прототип), а друга половина зрізів фарбувалася за новим, запропонованим нами способом. Після фарбування всі гістозрізи піддавали кінцевій обробці для виготовлення стандартних гістопрепаратів (таблиця 1). Таблиця 1. Технологія виготовлення та фарбування гістологічних препаратів кишечнику для виявлення келихоподібних клітин за різними способами Прототип Новий метод Відбір матеріалу Фіксація матеріалу у фіксаторах Карнуа, Буена Заливка матеріалу у парафін за стандартною схемою Одержання гістологічних зрізів, наклеювання їх на предметні скла та підсушування у термостаті Депарафінізація зрізів і доведення їх до води за стандартною схемою – Висушування препаратів 24 години при 37°С. Витримування препаратів у 6% фосфорномолібде– новій кислоті протягом 10 хвилин Промивання препаратів протягом 1 хвилини у дис– тильованій воді Фарбування препаратів зануренням у 0,1 % розчин Фарбування препаратів у 0,1% водному розчині маальціанового синього в 3-процентній оцтовій кисло- лахітового зеленого протягом 2 хвилин ті протягом 10-30 секунд Промивання у дистильованій воді Фіксація у 6% розчині фосфорномолібденової кис– лоти протягом 3 хвилин Фарбування гемалауном Ерліха протягом 5-10 хвилин, або 1% розчином нейтрального червоного – протягом 30 секунд, або 0,5% хлорантіновим міцним червоним 5В протягом 10-15 хвилин. Диференціація в 1% розчині спирту – Промивання в проточній воді протягом 10-20 хвиПромивають 2 хвилини у дистильованій воді лин Проведення через висхідний ряд спиртів, ксилол та поміщення у бальзам Келихоподібні клітини зафарбовуються у синьоКелихоподібні клітини зафарбовуються у інтенсивзелений колір ний яскраво-зелений колір При мікроскопічному досліджені готових препаратів встановили, що келихоподібні клітини диференціювалися при обох способах фарбування. Проте запропонований нами спосіб дозволив зробити це значно простіше, з використанням меншої кількості реактивів та затратою менших зусиль. Певні відмінності виявлено у якості зафарбування. Так, у препаратів, зафарбованих, новим способом, зафарбування келихоподібних клітин є більш яскКомп’ютерна в ерстка Н. Лисенко равим та насиченим порівняно з прототипом, вони контрастніше виділяються на фоні ворсинок. Запропонований нами спосіб також забезпечив чіткіше виявлення контурів келихоподібних клітин. Таким чином, запропонований нами метод фарбування келихоподібних клітин є зручним, надійним, не складним у практичному використанні, а тому більш ефективним порівняно з прототипом. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601