Спосіб виготовлення консерванту сперми

Спосіб виготовлення консерванту сперми, що включає зважування інгредієнтів та їх розчинення 3 36667 сервантом набуває негативні властивості, які проявляються значним підвищенням її в'язкості і оптичної щільності та втратою прозорості за наявності у ній безлічі жовткових кульок, що створює серйозні перешкоди для визначення біологічної активності статевих клітин методом мікроскопії і знижує вірогідність прогнозування запліднювальної здатності статевих клітин. Поряд з цим, яєчний жовток може бути забрудненим токсичними для сперміїв залишками лікарських препаратів, що використовуються на птахофермах для проведення лікувально-профілактичних заходів. В яєчному жовтку виявлені високі концентрації гормону прогестерону, який може провокувати передчасну акросомну реакцію сперматозоїдів і знижувати їх запліднювальну здатність. І на кінець, яєчний жовток є цінний і дефіцитний дієтичний харчовий продукт, використання якого у якості захисного компонента штучни х консервантів для сперми, призводить до значних матеріальних збитків. Поряд з цим додатковим фактором ризику мікробної контамінації сперми при застосуванні відомого консерванту є наявність у ньому крім курячого жовтка вуглеводу тваринного походження лактози, яка також буває в значній мірі забруднена мікрофлорою молока із якого її виготовляють. Будучи е фективним живильним середовищем для мікроорганізмів, розчин лактози, аналогічно жовтку, може бути джерелом мікробного забруднення сперми. Найбільш близьким прототипом є [„Середовище для кріоконсервування сперми та спосіб його виготовлення”, автори Осташко Ф.І., Павленко М.П., Павленко Л.Н.] його клас A6/D19/02, патент України №13138 від 28.02.97, Бюл. №1, яке складається із 11%-ного розчину вуглеводу, гліцерину, яєчного жовтка і розчину перекису водню, як антисептика, а спосіб його виготовлення включає паралельне приготування маточного розчину консерванта і розчину перекису водню, які змішують у реакторі в рівних об'ємах, герметизують в ампулах, прогрівають до 60-65°С, витримують 20-10 хвилин відповідно, охолоджують до кімнатної температури і зберігають до моменту використання, що забезпечує стерильність і довготривале зберігання консерванту. Недоліком відомого технічного рішення є складність процесу виготовлення консерванту, додаткові затрати, що обумовлено введенням в нього розчину антисептика - перекису водню і необхідністю використання спеціального дорого коштовного реактора для забезпечення протікання реакції розпаду перекису і окислення атомарним киснем мікроорганізмів та їх знезараження. Крім того, в процесі зберігання перекису водню він може знижувати свою антимікробну активність, що ускладнює точне його дозування за цими вимогами. При недостачі активності не забезпечується стерильність розбавлювача, а при передозуванні утворюються перекисні сполуки, які діють токсично на статеві клітини і знижують їх виживаність і запліднювальну здатність. До того ж застосування цього біотехнічного рішення пов'язано з використанням інгредієнтів тваринного походження. 4 Завданням корисної моделі є створення способу виготовлення стерильного консерванту, який забезпечує збереження високої санітарної і біологічної якості сперми та зниження матеріальних затрат шляхом заміни у відомому консерванті термолабільних компонентів тваринного походження, на термостабільні компоненти рослинної природи і застосування ефективних те хнічних засобів для здійснення даного способу. Поставлене завдання вирішується тим, що включає зважування інгредієнтів та їх розчинення дистильованою водою, відрізняється тим що замість інгредієнтів тваринного походження - жовтка і лактози у склад консерванту сперми вводять термостабільний ізототонічний екстракт насіння бобових рослин (сої, сочевиці, гороху або ж інших бобових культур), насіння яких попередньо піддають термообробці сухим паром під тиском 10001200МПа. протягом 25-20 хвилин, після чого його висушують, розмільчують до муки і із неї екстрагують водно-гліцериновим екстрагентом діючу речовину, яку герметизують в ампулах і стерилізують при 70-80°С, протягом 30-20 хвилин. Екстракт бобових являє собою ізотонічну композицію ліпопротеїдів і вуглеводів рослинного походження в комплексі з гліцерином. Насіння сої, наприклад, містить до 30% ліпопротеїдів та фосфоліпідів, а із вуглеводів у ньому вміщується понад 12% розчинних цукрів, насамперед дисахариду са харози та трисахариду ра фінози, які у складі консерванту сперми виконують роль екзоцелюлярних кріопротекторів. При виготовленні консерванту, попередня термічна обробка бобових застосована з метою інактивації наявних у насінні інгібіторів, шкідливих для статевих клітин, а кінцева термічна обробка здійснюється для забезпечення стерильності готового препарату з метою довготривалого зберігання його при плюсових температурах. Приклад. 1 Взяли навіску насіння сої сорту "Янтарний", вагою 100 грамів, засипали його у скляну колбу ємністю 500мл, горловину якої закрили пергаментною серветкою і колбу розмістили у автоклав. Насіння автоклавували за режимом 1000МПа, впродовж 20 хвилин. Після цього його розстелили одним шаром на листі фільтрувального паперу і висушили у термостаті при температурі 60 градусів, впродовж 12 годин. Висушене насіння розмололи лабораторним електромлином до стану муки, зсипали її у скляну колбу, залили водно гліцериновим екстрагентом кімнатної температури у співвідношенні 1:3, ретельно змішали і залишили при кімнатній температурі для екстрагування на 12 годин. В якості екстрагента використали 7%-ний розчин гліцерину в об’ємі 300 мілілітрів. Застосування гліцерину пояснюється тим, що у такій концентрації він проявляє високу проникну здатність і властивості сильнодіючого розчинника органічних сполук, що активізує гідролізні процеси і підвищує ефективність екстрагування. Разом з тим, розчин гліцерину у зазначеній концентрації виконує роль кріозахисного компонента, що виключає необхідність введення його у екстракт при виготовленні консерванта. 5 36667 Отриману після екстрагування суспензію розділили на фракції методом центрифугування при швидкості 7тис. обертів за хвилину і використали надосадкову рідину у якості консерванту. Його розфасували у скляні ампули із органічного скла об'ємом 30мл, які запаяли на полум'ї газової горілки. Загерметизовані таким чином ампули з консервантом піддали термічній обробці на водяній бані при температурах +60, 70, 80, 90, і 100°С з експозиціями 60, 40, 20, 10, і 5 хвилин, відповідно. Через 24 години після термообробки консервант досліджували на загальну мікробну забрудненість, після чого використовували його для роз 6 бавлення та заморожування сперми бугаїв. У якості контролю використовували прототип (11%ний розчин лактози - 63мл; жовток курячих яєць 30мл; гліцерин - 7мл.) Контрольний консервант готували у день проведення досліджень. Біологічні показники дослідного і контрольного консервантів визначали на спермі бугаїв, за рухливістю статеви х клітин після їх розморожування, а при бактеріологічних дослідженнях у консервантах визначали загальну кількість мікроорганізмів, тобто кількість їх колоній. Отримані дані наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Вплив різних режимів термічної обробки консерванта на якісні показники сперми при її низькотемпературному консервуванні Фізіологічні показники сперми Контроль 60°С/60хв Рухлив ість сперміїв після їх заморожув ання-в ідігрів ання, бали 4,4 Показник абсолютної в иживаності сперміїв в годинах, одиниці (Sa) 21,2 Вижив аність сперми при температурі 38°С, години (t) 7,4 Кількість мікробних тіл в 1мл. кріоконсерв анта 2000м.т./мл. Режим термічної обробки дослідного консерв анта 70°С/30хв 80°С/20хв 90°С/10хв 100°С/5хв . 4,5 4,5 4,6 3,9 3,5 22,7 23,2 22,5 17,2 14,1 8,3 8,8 8,2 6,8 6,1 17м.т./мл Стерильно Стерильно Наведені дані показують, що застосування консерванту для заморожування сперми після термічної обробки його за режимами у межах від 70°С/30 хвилин до 80°С/20хвилин, забезпечило стерильність і найбільш високі біологічні показники якості деконсервованої сперми. Приклад 2 За попередньою методикою виготовили кріоконсервант у об’ємі 500мл, розділили його на 5 рівних частин і розфасували по 40мл в 5 колб з притертими пробками. У перші 4 колби внесли тест-культури мікроорганізмів Stapfilococcus aureus, Streptococcus fecalis, Proteus yulgaris і Escherihia coli а у 5 колбу (контроль) мікроорганізми не вносили. Усі проби загерметизували пробками і витримали при кімнатній температурі впродовж 12 годин. Після цього вміст кожної колби розфасовували у скляні ампули, які герметизували Стерильно Стерильно на полум'ї газової горілки і піддавали прогріванню на водяній бані за режимом 70°С впродовж 30 хвилин. Після прогрівання ампул із кріоконсервантом їх о холодили до кімнатної температури 1618°С і зберігали при цій температурі протягом 12 місяців та досліджували консервант через кожні 3 місяці на його стабільність за санітарними та біологічними показниками. При цьому проби консерванта досліджували на мікробну забрудненість через 12 годин після внесення тест-культур мікроорганізмів, безпосередньо після термічної обробки, та через 3 - 6 - 9 і 12 місяців його зберігання. Дані цих досліджень показані в таблиці 2. Паралельно з цим досліджували вплив строків зберігання дослідного консерванту на виживаність сперми бугаїв при її низькотемпературному консервуванні. Отримані результати наведені у таблиці 2 і 3. Таблиця 2 Вплив термообробки консерв анта, штучно контамінов аного мікроорганізмами на його санітарну стабільність в залежності в ід термінів зберігання Мікробна забрудненість консерванта (мікробних кл. в 1 см 3) № Тест-культура мікроорганізмів 1 2 3 4 5 E.coli № 3 Proteus vulgaris № 2 Staphilococcus xyloz us № 6 Streptococcus faecalis № 14 Контроль (мікроорганізмів не в носили) Примітка: Стер.* - стерильно До в несення мікроорганізммів Після в несення мікроорганізмів Стер.* Стер. Стер. Стер. Стер. 25 тис. мк.кл/см 3 25 тис. мк.кл/см 3 25 тис. мк.кл/см 3 25 тис. мк.кл/см 3 Стер. Після термообробки при +75°С/30хв Стер. Стер. Стер. Стер. Стер. Термін зберігання, міс яців 3-12 Стер. Стер. Стер. Стер. Стер. 7 36667 8 Таблиця 3 Залежність біологічної стабільності консерв анта сперми в ід строків його зберігання Умов и і термін зберігання 0 Д Рухлив ість статевих клітин після заморожування-в ідігрів ання сперми, бали К Строки зберігання, місяців 3 6 9 12 Д К Д К Д К Д К 5,0 4,5 5,0 4,0 4,5 4,0 4,5 4,5 5,0 4,5 Примітка: Д* - дослід; К* - контроль. Приклад 3 Виготовили водний екстракт із соєвої муки без гліцерину, який розфасували у кожну із 5 колб по 100; 97; 95; 93 і 91мл, до яких внесли гліцерин, за методикою зустрічних рядів 1; 3; 5; 7 і 9мл, відповідно, як показано в таблиці 4. Отримані консерванти по 100мл в кожній колбі використали для за морожування сперми. Після розморожування сперми визначали вплив різних співвідношень екстракту і гліцерину в дослідних консервантах на рухливість сперміїв, виживаність їх при температурі 38°С та визначали показник абсолютної виживаності статевих клітин. Отримані дані наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Вплив різних співв ідношень екстракту і гліцерину на якісні показники сперми при її низькотемпературному консервуванні Об'ємні співв ідношення екстракту сої і гліцерину мас. % та якіс ні показники сперми бугаїв Екстракт насіння сої, мл 100 97 95 93 Гліцерин, мл 1 3 5 7 Рухлив ість сперміїв після реконсерв ації, бали 3,0 3,5 4,5 5,0 Вижив аність сперміїв при 38°С, години 6,0 8,0 9,0 10,0 Показник абсолютної в иживаності, Sa 10,0 12,4 14,2 15,0 Випробування запропонованого технічного рішення показали, що його практичне застосування у порівнянні з прототипом має такі переваги: - повністю виключає можливість контамінації сперми і статевих органів самиць збудниками захворювань, які передаються трансоваріальним шляхом; - створює умови для застосування простих і ефективних засобів стерилізації консерванту та довготривалого його зберігання. Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 91 9 4,0 7,0 10.1 - спрощує те хнологію виготовлення і знижує трудові і матеріальні затрати у 5-6 разів; - забезпечує збереження стерильності консерванту не менше 12 місячного терміну зберігання в умовах кімнатної температури; - підвищення виживаності і запліднювальної здатності сперміїв на 16-18% за рахунок усунення токсичного та мікробного факторів; - повністю виключає необхідність використання дефіцитного дієтичного жовтка. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601