Спосіб лікування хворих з цирозом печінки та профілактики його ускладнень

Спосіб лікування хворих з цирозом печінки та профілактики його ускладнень, що включає системне застосування кордової крові людини з диметилсульфоксидом, збагаченої мононуклеарними клітинами, в ефективній кількості, достатній для трансдиференціювання, який відрізняється тим, що додатково виконують лікування хворих з ускладненим перебігом білярного цирозу, асцитом та вираженими метаболічними порушеннями шляхом застосування гемопоетичних клітинпопередників кордової крові (ГКП КК), які безпосередньо перед введенням реципієнту короткочасно (5 хвилин) інкубуються з монолігандними пептидами плазмових факторів реципієнта, в результаті чого ГКП КК здатні до трансдиференціювання під впливом конкретних факторів мікрооточення реципієнта; ГКП КК використовували після ренгенваскулярного кліпування кровоточивих вен стравоходу; проводили тестування клітинного матеріалу сателітного зразка після забору кордової крові перед кріоконсервуванням на: стерильність, відсу U 2 (19) 1 3 37688 дії 24-26 тижнів гістації: через 16-24 години після введення спостерігалися зміни білоксинтезуючої активності, зниження концентрації білірубіну, печінкових ферментів - АЛТ, ACT, ЛДГ, а до 12 дня спостереження - нормалізація рівня холестерину, подальше зниження білірубіну. Недоліком даного методу є використання авторами високодиференційованих клітин - гепатоцитів, які мають на своїй поверхні експресовані антигени гістосумісності HLA І та II класу. В результаті наведеного способу лікування, з великою вірогідністю можливе виникнення значних порушень гемостазу у вигляді розвивитку ДВСсиндрому і тромбозів на тлі значного підвищення протромбіну. Виявлений авторами розвиток коагулопатій, очевидно, став наслідком формування негайної відповіді імунокомпетентних клітин реципієнта на чужорідні диференційовані гепатоцити. Відомий також процес лікування алкогольного цирозу з метою нормалізації відновлюючих процесів, що включає трансфузію в периферинний кровоток мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин кісткового мозку (МСК) пацієнтам з декомпенсованим алкогольним цирозом печінки, який був застосований Теrаі S., Ishikawa Т., Omori К. та ін. [Terai S., Ishikawa Т., Omori К. et al. Improved lived function in patients with liver cirrhosis after autologus bone marrow cell infusion therapy //Stem cells. -2006. -V.24. -№10. -P.2292 - 298]. Цьому передували експериментальні дослідження інших авторів на тваринних моделях гострого і хронічного ушкодження печінки, в яких показано прискорення регенерації печінки у випадку застосування гранулоцитарного колонійстимулюючого фактору (G-GSF) у дозах, необхідних для мобілізації аутогенних мезензімальних гемопоетичних стовбурови х клітин (ГСК) з кісткового мозку [Yannaki Ε., Athanosiou Ε., Xagorari et al. G-CSFprimed hepatopoietic stem cells or G-GSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury, predominantly by promoting endogenous repair programs //Exp. Hematol. -2005. -V.33 -№1. -P.108 119]. Результатом запропонованого методу трансплантації МСК для лікування пацієнтів з декомпенсованим алкогольним цирозом печінки було усунення гострих печінкових ускладнень (шлунковокишкові кровотечі, неконтрольований асцит, печінкова енцефалопатія), значне продовження життя пацієнтів, покращання клінічних показників, що оцінювали за шкалою Child-Pugh та MELD. Недоліком даного методу є застосування мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин кісткового мозку, які невиправдано вважаються найбільш привабливим джерелом матеріалу для регенеративної медицини, тому що існує реальна можливість онкогенної трансформації [Riggi N., Cironi L., Provero P. et al. Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells //Cancer Res. -2006. V.65. -P.11459-11468]. Наявна достатня кількість результатів досліджень, що застерігають від передчасного широкого застосування мезенхімальних стовбурових клітин у зв'язку з ризиком онтогенетичної трансформації цих клітин. За даними багатьох авторів, МКС при певних умовах in vitro 4 чи при індукції онкогенами після трансформації in vi vo у реципієнтів викликають розвиток пухлин [Miura Μ., Miura Y., Padilla-Nash N.M. et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation //Stem Cells. -2006. -V.24. -№4. P.1095-1103; Wang Y., Huso D.L., Harrington J.et al. Outgrowth of transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture //Cytotherapy. -2005. -V.7. -№6. -P.509-519]. В роботах [Rubio D., Garsia-Castro J., Martin MC, de la Fuente R. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation //Cancer Res. -2005. -V.65. -№8. P.3035-3039; Tolar J., Nauta A.J., Osborn M.J. et al. Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells. Stem Cells 2007; 25(2):371-9] також було вивчено спонтанний канцерогенез МСК миші та людини без впливу будь-яких індукуючи х факторів. Автори показали, що онкогенна трасформація проходить не в усіх зразках, але після культивування адгезивної фракції мононуклеарів на певних пасажах клітини формували трьохвимірні структури. Найбільш близьким до корисної моделі по суті і результату є процес трансплантації мононуклеарних клітин кордової крові людини при лікуванні циркулюючих порушень, зокрема інфаркту міокарда [патент №20040197310 A1, пр. 12.02.2004, опубл. 07.10.04. Compositions and methods for using umbilical cord progenitor cells in the treatment of myocardial infarction. Samberg P.L. et al.]. Спосіб включає: - визначення враженої ділянки в серці; - системне, безпосередньо у серцеву тканину, застосування гемопоетичних клітин-попередників кордової крові; - використання у якості трансплантата кордової крові з диметилсульфоксидом, збагаченої мононуклеарними клітинами (кордову кров застосовували через 6-12 годин після виникнення інфаркту); - застосування кордової крові в ефективній кількості, достатньої для трансдиференціювання в кардіоміоцити; - склад клітинної суспензії: 1мл клітинної суспензії вміщував 6-9млн. лейкоцитів, з яких приблизно 10-14% - гранулоцити, 1-4% - CD34+ клітини. В останні роки в результаті багатьох досліджень показано, що кордова кров є багатим джерелом гемопоетичних і мезенхімальних стовбурових клітин. Гемопоетичні клітини кордової крові проліферують у вісім разів активніше, ніж клітини кісткового мозку і експресують на своїй поверхні достатню кількість кластерів диференціювання CD 14, CD 34, CD 45. Ці клітини є продуцентами інтерлейкінів та тромбопоетину, який викликає проліферацію гемопоетичних клітин та пригнічує апоптоз. 85% клітин кордової крові знаходиться у фазі клітинного циклу G1/G0. Ці клітини здатні формувати екстрацелюлярні хемотаксичні білки та молекули адгезії (ІСАМ І, ІСАМ III). Використання кордової крові в якості джерела гемопоетичних стовбурових клітин є позитивною рисою відомого процесу, оскільки мононуклеарні 5 37688 клітини кордової крові можуть використовуватись у якості алло- та аутотрансплантатів (клітини кордової крові можуть експресувати фібрилярні кислі білки типу альфа-тубуліну), процес отримання гемопоетичних клітин з кордової крові не має етичних обмежень (порівняно з використанням ембріональних клітин людини), відносно простий і не травмонебезпечний (на відміну від методів отримання клітин з кісткового мозку). Лікування відомим засобом призводило до значного зменшення розміру рубця, що виник внаслідок перенесеного інфаркту. Відновлювалась систолічна та діастолична функція серця, покращувалась еластичність та скорочувальність серцевої мускулатури. В основу корисної моделі поставлено завдання створення вдосконаленого способу лікування цирозу печінки та профілактики його ускладнень шляхом сумісного застосування монолігандних пептидів і клітинних трансплантатів, здатних до трансдиференціювання під впливом плазмових факторів in vitro і факторів мікрооточення, який дозволяє налагодити метаболічні та імунофізіологічні порушення. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі лікування хворих з цирозом печінки та профілактики його ускладнень за допомогою гемопоетичних клітин-попередників кордової крові, що включає системне застосування кордової крові людини з диметилсульфоксидом, збагаченої мононуклеарними клітинами, в ефективній кількості, достатній для трансдиференціювання, згідно з корисною моделлю, додатково проводять: - лікування хворих з ускладненим перебігом білярного цирозу, асцитом та вираженими метаболічними порушеннями (ГКП КК використовують після рентгенваскулярного кліпування кровоточивих вен стравоходу); - тестування клітинного матеріалу при заборі кордової крові; - реконсервацію препарату гемопоетичних клітин попередників кордової крові; - тестування клітинного матеріалу після реконсервації; - обробку реконсервованих клітин кордової крові безпосередньо перед трансфузією плазмою реципієнта; - оцінювання імунологічних та біохімічних показників у хворих з цирозом печінки. Заявнику не відомі приклади лікування цирозу печінки та профілактики його ускладнень за допомогою трансфузії препарату клітин кордової крові, обробленого плазмою реципієнта. Суть корисної моделі ілюструється прикладом її конкретного виконання. На першому етапі з метою забезпечення безпечності та виключення контамінації інфекційними агентами обов'язкове тестування клітинного матеріалу сателітного зразка після забору кордової крові перед кріоконсервуванням на: 1) стерильність, 2) відсутність патогенних вірусів і бактерій (сифілісу, ВІЛ-інфекції, гепатитів В і С, краснухи, герпесу, цитомегаловірусу, токсоплазмозу, мікоплазми), 3) наявність відповідних еритроцитарних антигенів за системою А, В, О і Rh, 4) наявність фенотипу та щільність рецепторів лейкоцитарних 6 антигенів гістосумісності І (А, В, С) та II (HLA-DR) класів, 5) ідентифікацію кластерних маркерів (Thyl - T-cell associated antigen (або CD90), Sca-1 - stem cell antigen 1, глікофорин CD34, CD38, CD45, CD133, CD164, родамін 123, AC 133). На другому етапі проводили миттєву реконсервацію препарату гемопоетичних клітинпопередників кордової крові, збагаченого мононуклеарними клітинами, з 3% диметилсульфоксидом у якості кріопротектору, на водяній бані в об'ємі 30мл при температурі 38°С. Клітинний матеріал сателітного зразка тестували після реконсервації відповідно з Міжнародною регламентацією оцінювання клітинних трансплантатів на: 1) життєздатність клітин при тотальному забарвлюванні трипановим синім (не менше 80±10% від початкової), 2) клоногенну активність в тесті КУЕ-ГМ (1-15×106), 3) проліферативну активність, 4) аномальну токсичність (препарат повинен бути не токсичним), 5) pH (7,0±0,2), 6) вміст загального білку (21,0±0,8г/л). У пацієнтів з цирозом печінки здійснювали забір крові з антикоагулянтом у кількості 10мл. Після центрифугування до 1мл плазми додавали 40мл реконсервованої суспензії гемопоетичних клітинпопередників кордової крові, при цьому відбувався вплив плазмових факторів крові реципієнта на експресію екстрацелюлярних рецепторів гемопоетичних клітин кордової крові. Після 5-7 хвилинної експозиції проводили внутрішньовенне крапельне введення отриманої суспензії клітин у ліктьову вену пацієнтів. При використанні запропонованого способу застосування гемопоетичних клітин-попередників кордової крові у хворих з цирозом печінки встановлено нормалізацію показників неспецифічної резистентності організму (фагоцитарна активність гранулоцитарних нейтрофілів, активність білків системи комплементу), експресії дифернціювальних рецепторів лімфоцитів CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD16, CD19, CD50, CD54, CD162, показників гуморального імунітету та цитокінів (IgA, Ig M, IgG, IgE, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІНФ, концентрація та розміри циркулюючих імунних комплексів, пептидів середньої молекулярної маси, вміст прозапальних та протизапальних цитокінів, органоспецифічних антитіл), біохімічних показників крові (білкові фракції, показники ліпідного профілю, печінкові ферменти, тимолова проба). Верифіковані нами зміни імунологічних та біохімічних параметрів корелювали зі значним покращанням клінічних проявів захворювання. У пацієнтів зупинялася кровотеча із варікозно розширених вен стравоходу на тлі кліпування судин, значно знижувався асцетичний вихід, спостерігалося покращання самопочуття, працездатності, зниження больового синдрому, дискомфорту у системі травлення. Таким чином, запропонований процес дозволяє налагодити метаболічні та імуннофізіологічні порушення у пацієнтів, хворих цирозом печінки шляхом сумісного застосування монолігандних пептидів і клітинних трансплантатів, які здатні до трансдиференціювання під впливом сироваткових факторів in vitro і факторів мікрооточення. 7 Комп’ютерна в ерстка С.Литв иненко 37688 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601