Спосіб визначення молекулярно-генетичних маркерів діагнозу та прогнозу у дітей, хворих на рабдоміосаркому

Спосіб визначення молекулярно-генетичних маркерів діагнозу та прогнозу у дітей, хворих на рабдоміосаркому, що включає дослідження наявності химерних транскриптів в пухлині, який відрізняється тим, що у хворих додатково забирають зразки кісткового мозку до, в процесі та після проведеного лікування та проводять двоетапне молекулярно-генетичне дослідження методом полімеразно-ланцюгової реакції з детекцією результатів в режимі реального часу і, в випадку позитивних результатів, діагностують альвеолярну рабдоміосаркому, встановлюють відповідну стадію захворювання та стратифікаційну груп у. (19) (21) u200810009 (22) 01.08.2008 (24) 10.12.2008 (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) ХРАНОВСЬКА НАТАЛЯ МИКОЛАЇВН А, U A, КЛИМНЮК ГРИГОРІЙ ІВАНОВИЧ, UA, ІОНКІНА НАТАЛІЯ ВАЛЕРІЇВН А, U A, КАРАЧАРОВА ІРИНА ЮРІЇВНА, U A, БАЛИЦЬКА ОКС АНА ВОЛОДИ МИРІВНА, U A, ШАЙДА ОЛЕН А ВІКТОРІВНА, UA, СВЕРГУН НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВН А, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАЦІОН АЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ", U A 3 37943 Недоліком даного способу є те, що реакція проходить в один етап, тобто етапи зворотньої транскрипції та власне ПЛР об'єднані, що виключає можливість попередньої, до проведення ПЛР, перевірки якості одержаної кДНК та груп ування її зразків з метою перевірки одержаного результату в подальшому. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення молекулярногенетичних маркерів діагнозу та прогнозу у ді тей, хворих на РМС, шляхом дослідження наявності химерних транскриптів РАХЗ- FKHR та РАХ7FKHR в пухлині та КМ за допомогою двоетапної ПЛР з детекцією кінцевого результату в режимі реального часу, що дасть можливість диференційної діагностики форм РМС, прогнозу перебігу захворювання, уточнення стадії захворювання, визначення «груп ризику», оптимізації програм терапії, моніторингу ефективності лікування. Поставлена задача вирішується наступним чином: У хворих отримували зразок пухлини шля хом трепан - або відкритої біопсії або (та) пунктат KM з трьох точок (грудини, лівого та правого крила клубової кістки). Біоптат пухлини поміщали в мікро пробірки з 0,3 мл RNA-later фірми "Ambion" (США) для стабілізації РНК. Кістковий мозок переносили в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (6% ЕДТА в співвідношені 1:20 або 3,8% розчин цитрату Na в співвідношенні 1:9). Пробірки обережно перевертали декілька разів для змішування кісткового мозку з антикоагулянтом. Забір, транспортування та зберігання біологічного матеріалу проводили згідно рекомендацій фірмивиробника RNA-later. Загалом, протягом 1 доби матеріал зберігали при 2-8°С, довготривало - при 70°С. РНК з пухлинної тканини виділяли за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно рекомендацій фірмивиробника. РНК з KM виділяли методом кислотнофенольної екстракції, використовуючи ПЛР-тестнабір "Рибо-золь" фірми "Амплісенс" (Росія), згідно рекомендацій фірми виробника. Для роботи з РНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, які мають спеціальне маркування "Rnase-free", "Dnase-free". Використанний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезинфікуючий 5%-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/ m 1) в присутності RNase inhibitor (10 U/ m 1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37°С та протягом 5 хв. при 75°С з метою позбавлення від геномної ДНК, яка в даному випадку може бути джерелом хибних результатів. Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). Першим етапом маніпуляцій з отриманою РНК було проведення реакції зворотньої транскрипції. Для цього використовували ПЛР-тест-набір "Реверта-L-100" фірми "Амплісенс" (Росія) згідно рекомендацій фірми-виробника. Отриману в результаті реакції зворотньої транскрипції кДНК, розводили в 2 рази ДНК-буфером. 4 Контроль якості отриманої кДНК проводили на основі визначення експресії гену b-microglobulin (b2M), який є "house-keeping" геном, що в нормі експресується в кожній клітині. Для цього проводили реакцію ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США) та праймерів і зонду: b 2М (forward primer) GAGTATGCCTGCCGTGTG b 2M (reverse primer) AATCC AAATGCGGCATCT - FAM-CCTCCATGATGCTGCTTAC ATGTCTCTAMR A Праймери використовували в концентрації 10 m М, зонд - 20 m М. Готували таку реакційну суміш: 0,25 мкл forward primer, 0,25 мкл reverse primer, 0,125 мкл zond, 12,5 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems", США, 6,875 мкл ПЛРводи, 5 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 50°С -2 хвилини, 95°С 10 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95°С - 15 секунд і 60°С - 1 хвилина. Одну частин у отриманої кДНК використовували для проведення реакції ПЛР, іншу зберігали при -20°С протягом 3 місяців та при -70°С протягом року. Після закінчення реакції ампліфікації облік одержаних результатів проводили в режимі реального часу згідно рекомендацій фірмивиробника приладу. Другий етап методу визначення химерних транскриптів включав проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems" (США), з такою послідовністю: PAX(forward primer) CCTCCAACCMC ATGAACCC FKHR(reverse primer) CCTTCATTCTGCAC ACGAATGA 3F-VICTGGC AATGGCCTCTCACCTCAC AATT-TAMR A 7F-6FAMAGC AACGGCCTGTCTCCTCAGAATTC A-TAMR A Праймери використовували в концентрації 0,4mM, зонди – в концентрації 0,1mМ. Для проведення реакції ампліфікації готували таку реакційну суміш: 1мкл forward primer, Імкл reverse primer, 0,5 мкл zond 3F та 0,5 мкл zond 3F, 12,5 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems", США, 10 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95°С - 10 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95°С - 15 секунд і 65°С - 1 хвилина. По закінченню реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірмивиробника приладу. При визначенні позитивного результату, тобто наявності химерних транскриптів PAX3-FKHR або PAX7-FKHR в пухлині, ми можемо діагностувати у 5 37943 хворого РМС альвеолярного типу, встановити належність хворого до певної „групи ризику", при наявності химерних транскриптів в KM ми можемо констатувати наявність метастазування або мінімальної дисемінованої хвороби в KM, уточнити стадію захворювання. Все вищевикладене дозволяє оптимізувати програму терапії хворого. Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені результати молекулярно-генетичних досліджень пухлини та KM двох хворих. І. Хвора Ф.Н.В., 2000 року народження (амб. медична карта №6884/08) поступила на консультацію в ДУ „Національний інститут раку" з діагнозом екстрадуральна пухлина на рівні Th7-Th9, ПГЗ № 2762-64/08: альвеолярна рабдоміосаркома. Проведено операційне тотальне видалення пухлини. У хворої отримували зразки KM з трьох точок (з грудини, лівого та правого крила клубової кістки з антикоагулянтом (6% ЄДТА в співвідношені 1:20 або 3,8 % розчин цитрату Na в співвідношені 1:9) до та після проведеного лікування. РНК з KM виділяли методом кислотнофенольної екстракції, використовуючи ПЛР-тестнабір "Рибо-золь" фірми "Амплісенс" (Росія), згідно рекомендацій фірми виробника. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/ m 1) в присутності RNase inhibitor (10 U/ m 1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37°С та протягом 5 хв при 75°С з метою позбавлення від геномної ДНК Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). Першим етапом маніпуляцій з отриманою РНК було проведення реакції зворотньої транскрипції. Для цього використовували ПЛР-тест-набір "Реверта-L-100" фірми "Амплісенс" (Росія) згідно рекомендацій фірми-виробника. Отриману в результаті реакції зворотньої транскрипції кДНК, розводили в 2 рази ДНК-буфером. Контроль якості отриманої кДНК проводили на основі визначення експресії гену b 2-microglobulin ( b 2M), який є "house-keeping" геном, що в нормі експресується в кожній клітині. Другий етап методу визначення химерних транскриптів включав проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems", США. з такою послідовністю: - PAX(forward primer) -CCT-CCA-ACC-MC ATGA-ACC-C - FKHR(reverse primer) - CCT-TCA-TTC-TGCAC A-CGA-ATG-A - 3F-VIC-TGG-C AA-TGG-CCT-CTC-ACC-TC ACAA-TT-TAMRA 7F-6FAM-AGC-AAC-GGC-CTG-TCT-CCTCAG-AAT-TCA-TAMRA Праймери використовували в концентрації 0,4mM, зонди – в концентрації 0,1mМ. Для проведення реакції ампліфікації готували таку реакційну суміш: Імкл forward primer, Імкл reverse primer, 0,5 мкл zond 3F та 0,5 мкл zond 3F, 12,5 мкл TaqMan 6 Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США), 10 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95°С - 10 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95°С - 15 секунд і 65°С - 1 хвилина. По закінченню реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірмивиробника приладу. В результаті досліджень до лікування у хворої був виявлений химерний транскрипт PAX3-FKHR в 3-х зразках KM, що свідчить про наявність метастазів РМС у KM. Враховуючи виявлене ураження КМ, у хворої була констатована IV стадія захворювання з поганим прогнозом та показана хіміотерапія згідно протоколу CWS-2005. Після проведення 3-х курсів хіміотерапії, через 3 місяці після початку лікування, було здійснене повторне молекулярногенетичне дослідження КМ. В результаті дослідження химерний транскрипт PAX3-FKHR виявлено не було, що свідчить про правильний вибір стратегії лікування і доводить його ефективність. II. Хвора П.В.О., 2006 року народження. Поступила на консультацію в ДУ „Національний інститут раку" з діагнозом ембріональна рабдоміосаркома, що був поставлений в Російському онкологічному науковому центрі ім.М.М.Бло хіна, ПГЗ № 7273-75/07. Лікування хвора проходить в Київський міській онкологічній лікарні (історія хвороби №114/42). У хворої отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. З пухлинної тканини виділяли РНК за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно рекомендацій фірми-виробника. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/ m 1) в присутності RNase inhibitor (10 U/ m 1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37°С та протягом 5 хв. при 75°С з метою позбавлення від геномної ДНК Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). Першим етапом маніпуляцій з отриманою РНК було проведення реакції зворотної транскрипції. Для цього використовували ПЛР-тест-набір "Реверта-L-100" фірми "Амплісенс" (Росія) згідно рекомендацій фірми-виробника. Отриману в результаті реакції зворотньої транскрипції кДНК, розводили в 2 рази ДНК-буфером. Контроль якості отриманої кДНК проводили на основі визначення експресії гену b 2-microglobulin (( b 2М), який є "house-keeping" геном, що в нормі експресується в кожній клітині. Другий етап методу визначення химерних транскриптів включав проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Byosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Byosystems", США. з такою послідовністю: - PAX(forward primer) -CCT-CCA-ACC-MC ATGA-ACC-C - FKHR(reverse primer) - CCT-TCA-TTC-TGCAC A-CGA-ATG-A - 3F-VIC-TGG-C AA-TGG-CCT-CTC-ACC-TC ACAA-TT-TAMRA 7 37943 7F-6FAM-AGC-AAC-GGC-CTG-TCT-CCTCAG-AAT-TCA-TAMRA Праймери використовували в концентрації 0,4mM, зонди – в концентрації 0,1mМ. Для проведення реакції ампліфікації готували таку реакційну суміш: 1мкл forward primer, 1мкл reverse primer, 0,5 мкл zond 3F та 0,5 мкл zond 3F, 12,5 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США), 10 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95°С - 10 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95°С - 15 секунд і 65°С - 1 хвилина. По закінченню реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірмивиробника приладу. В результаті досліджень у хворої був виявлений химерний транскрипт PAX3-FKHR в п ухлині, що свідчить про належність пухлини до РМС альвеолярного типу, що характеризується поганим прогнозом. Виходячи з цього, хворій було поставлено діагноз альвеолярна РМС, встановлена належність до „групи високого ризику", та призначено лікування за протоколом EpSSG RMS-2005 для альвеолярних РМС. В ході клінічних спостережень у хворої встановлена рефрактерність до І та II ліній хіміотерапії. Таким чином, визначення химерних генів PAX3/7-FKHR в клітинах пухлини та КМ за допомогою вищевикладеного методу дозволяє діагностувати РМС альвеолярного типу; відповідним чином провести стратифікацію хворих; уточнити ступінь розповсюдженості процесу; визначити повноту досягнутої ремісії та забезпечує можливість оптимізації програм терапії. Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 8 Джерела інформації. 1. Бондарь И.В. Злокачественные новообразования у детей: заболеваемость, смертность, продолжительность жизни // Российский онкологический журнал.-2002.-№ 1.-С.43-44. 2. Breneman J. Prognostic factors and clinical outcomes in children and adolescents with metastatic rhabdomyosarcoma - a report from the intergroup Rhabdomyosarcoma study IV // J. Clin. Oncol. - 2003. - Vol.21, p.78-84. 3. Иммуноцитохимическая диагностика сарком из малых округлых клеток / Скляренко Л.М., Глузман Д.Ф., Надгорная В.А. и др. // Онкология.-2005.Т.7, № 4.-С.327-329. 4. Діагностика метастазів в кістковому мозку у дітей зі злоякісними пухлинами / Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Климнюк Г.І. та ін. // Гематологія.2007. -34 с. 5. Молекулярные и цитогенетические маркеры солидных опухолей у детей / Рушковский СР., Афанасьева Е.С., Безруков В.Ф. и др. // Онкология.-2005.-Т.7,№4.-С.309-314. 6. PAX3-FKHR and PAX7-FKHR gene fusions are prognostic indicators in alveolar rhabdomyosarcoma: a report from the Children's Oncology Group / Sorensen P.H.B., Lynch J.C., Qualman S.J. et.al. // J. of Clinical Oncology.- 2002.V.20, N 11.-P.2672-2679. 7. Barr F., Smith L., Lynch J. et al. Examination of gene fusion status in archival sample of alveolar rhabdomyosarcoma entered on the intergroup rhabdomyosarcoma study-Ill trial // J. of Molecular Diagnostics. - 2006. - Vol.8, No.2,P.202-208 (прототип). Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601