Спосіб визначення ефективності стимуляції розвитку ооцит-кумулюсних комплексів

Спосіб визначення ефективності стимуляції розвитку ооцит-кумулюсних комплексів, що включає вимірювання площі клітини, її структурних частин і обчислення відношення цих площ, який відрізняється тим, що вимірюють площі і обчислюють відношення площ за відеозображенням живих клітин кумулюса та ооцита у складі ОКК до стимуляції розвитку ОКК та дозрілого після стимуляції ОКК, використовуючи комп'ютерну програму, а про ефективність стимуляції судять за значенням коефіцієнта, що являє собою відношення цих відношень. (19) (21) u200810141 (22) 06.08.2008 (24) 25.12.2008 (46) 25.12.2008, Бюл.№ 24, 2008 р. (72) КОЛЕСНІКОВА АЛЛА ОЛЕКСАНДРІВН А, U A, ШИГИМАГА ВІКТОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ, U A, ПОГОРЄЛОВ ОЛЕКСАНДР СТЕП АНОВИЧ, U A, С МОЛЬЯНІНОВА ЄВГЕНІЯ ІВАНІВН А, UA (73) КОЛЕСНІКОВА АЛЛА ОЛЕКСАНДРІВН А, U A, ШИГИМАГА ВІКТОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ, U A, ПОГОРЄЛОВ ОЛЕКСАНДР СТЕП АНОВИЧ, U A, С МОЛЬЯНІНОВА ЄВГЕНІЯ ІВАНІВН А, UA 3 38223 ризується тим, що в цитологічних препаратах, одержаних шляхом пункції пухлини і зіскобу з розрізу тканини, вимірюють периметр і площу клітини, площу ядра, ядерно-цитоплазматичне відношення, а за цими параметрами і їх відносними значеннями визначають варіант раку, використовуючи для морфометрії клітин щитовидної залози будьякий відповідний доступний приладцитоаналізатор або комп'ютерну програму. Проте, цей спосіб допускає вимірювання тільки самих площ клітин і їх структурних елементів і не враховує зміну їх співвідношення до таких в нормі і патології, при яких клітини, особливо пухлинні, можуть міняти свої геометричні параметри в процесі неконтрольованої проліферації. Цей спосіб, так само, як і вищеописані, допускає морфометрію тільки забарвлених і фіксованих препаратів, тобто неживих клітин. Крім того, автоматизована комп'ютерна морфометрія за допомогою цитоаналізатора можлива тільки на клітинах, що мають чіткі межі і добре помітні на рівні фону. Інакше комп'ютерний аналіз відеозображення клітини за градієнтом яскравості, що лежить в основі роботи більшості прикладних програм для морфометрії, не в змозі розрізнити фон від розмитої або нечіткої межі клітини, яскравість якої майже зливається з фоном. Такими є клітини кумулюса в ОКК. Більш того, в процесі розвитку ОКК в культурі кумулюс розпушується, що ще більш ускладнює задачу автоматичного аналізу (оконтурювання) зображення. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб визначення об'єктивного критерію зовнішнього стимулюючого впливу на розвиток ОКК шля хом проведення комп'ютерної морфометрії відеозображення живих клітин у складі ОКК. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає вимірювання площі клітини, її стр уктурних частин і обчислення відношення цих площ, згідно з корисною моделлю, вимірюють площі і обчислюють відношення площ за відеозображенням живих клітин кумулюса та ооцита у складі ОКК за допомогою комп'ютерної програми до стимуляції розвитку ОКК та дозрілого після стимуляції ОКК, а про ефективність стимуляції судять за значенням коефіцієнта, що являє собою відношення цих відношень. Суть корисної моделі пояснюється рисунками. На них показані отримані відеозображення ОКК з ооцитом всередині, які обведені за допомогою компьютерної програми: фіг. 1 а) - контрольний ОКК (без стимуляції) до, та б) - він же після культивування; фіг. 2 а) - дослідний ОКК до стимуляції та б) - він же, стимульований електромагнітним полем після культивування. Спосіб здійснюють таким чином. Ооцити у складі ОКК видаляють шляхом проколу антральних фолікулів яєчника у фосфатно-буферному середовищі Дюльбеко (ФБСД) з додаванням 10 % фетальної сироватки теляти. Для подальшої роботи у тому ж середовищі вибирають ооцити з багатошаровим компактним кумулюсом та рівномірно 4 гранульованою цитоплазмою. Записують відеозображення мікроскопованих ОКК будь-яким зручним способом. Далі безпосередньо у тому ж самому середовищі поодинокий ОКК або групу ОКК піддають дії електромагнітного поля різної енергії (стимулюють) і ставлять їх на культивування одночасно з контрольними (нестимульованими) ОКК. Через час, необхідний для дозрівання ооцитів in vitro, проводять повторний відеозапис стимульованих та контрольних ОКК. Після цього всі відеозображення, що одержані до та після культивування стимульованих та контрольних ОКК відповідно, вводять в комп'ютерну програму і обробляють наступним чином. За допомогою комп'ютерної миші обводять окремо контури кумулюса і ооцита в ньому і автоматично за допомогою програми одержують відповідні площі та їх відношення (фіг. 1, 2). Потім обчислюють відповідний коефіцієнт К як відношення одержаних відношень площ кумулюса і ооцита після та до стимуляції. Величина К приймає значення більше або рівне одиниці. В останньому випадку вважають, що стимуляція неефективна або надмірна (приводить до пригноблення розвитку ОКК). Приклад. У якості модельного об'єкту вибрані ОКК миші. Виділені та відібрані за станом кумулюсу та цитоплазми ОКК миші випадковим чином розподіляються на дослідну та контрольну групи і до початку культивування час їх перебування в ФБСД однаковий. Далі безпосередньо у цьому ж середовищі до щойно виділеного ОКК за допомогою мікроелектродів подають стимулююче імпульсне електромагнітне поле з енергією 1,4 та 2,1 мкДж на ОКК. Після цього ОКК дослідних та контрольної груп культивують у середовищі Wa ymouth MB 752/1, доповненому бікарбонатом натрію, піруватом натрію та 15 % фетальної сироватки теляти, протягом 16год. Проводять відеозапис дослідних та контрольних ОКК перед культивуванням та після нього. Далі отримані зображення у цифровому вигляді вводять в спеціально розроблену комп'ютерну програму, за допомогою миші обводять окремо контури кумулюса і ооцита. За допомогою програми автоматично одержують відповідні площі та їх відношення, які наведені нижче у таблиці. Не дивлячись на уявну перевагу за площею дозрілого контрольного не-стимульованого ОКК (фіг. 1 б) над стимульованим дозрілим (фіг. 2 б), значення К складає для контрольного ОКК К=2,758, в той час, як аналогічна величина для стимульованого ОКК К=5,007, що доводить факт стимулюючого впливу електромагнітного поля на розвиток ОКК. Як випливає з даних таблиці, значення коефіцієнта К для контрольних ОКК не перевищують 3, тоді як у стимульованих ОКК цей коефіцієнт має максимальне значення вище 6, що показує добрий стимулюючий ефект. Інші значення коефіцієнта К для стимульованих ооцитів змінюються від 1,35 до 5,6, ілюструючи ступінь стимулюючого впливу електромагнітного поля різної енергії на розвиток ОКК. 5 38223 6 Таблиця. Площі ооцитів та кумулюсів стимульованих і контрольних ОКК до (1) та після (2) культивування (мкм 2). № ОКК Площа ооцита s1 s2 1 2 3 7645,1 5122,3 7361,3 3534,2 4042,6 7112,4 4 5 6 6066,6 5209 7265,6 4698,3 4348,5 5235,1 7 8 9 10 5351,5 4157,2 6145 5074,2 3897,1 4756 4367,5 4108,5 Площа кумулюса S1 S2 S1/s1 Контроль 10420,4 13731,9 1,363 32526,1 70766,7 6,350 13398,1 16545,2 1,820 Стимульовані, 1,4 мкДж 8594,8 41243,8 1,417 13374,4 55899,3 2,568 14381,6 13971,8 1,979 Стимульовані, 2,1 мкДж 12371,9 50334,5 2,312 8562,1 29969,4 2,060 14270 27859,4 2,322 13442,1 27384,8 2,649 Усередині груп ОКК спостерігається розкид значень К, які показують результативність розвитку ооцитів залежно від їх первинної якості. Середнє значення К у контролі (№ № 1-3) і при енергіях стимуляції 1,4 мкДж (№ № 4-6) і 2,1 мкДж (№ № 710) складає, відповідно, 2,295; 4,184 і 3,477, що дозволяє заключити, що обидві енергії мають стимулюючий ефект по відношенню до контролю, причому, енергія 1,4 мкДж має більший стимулюючий вплив, ніж 2,1 мкДж, яка, скоріш за все, має невеликий пригнічуючий ефект. Це дає можливість прогнозувати, що енергія вища, ніж 2,1 мкДж буде мати ще більший пригнічуючий ефект на розвиток ОКК. Запропонованій спосіб, на відміну від відомих аналогів та прототипу, передбачає морфометрію відеозображення живих клітин у складі ОКК за допомогою комп'ютерної програми. Спосіб також враховує і показує динаміку відношень площ кумулюса і ооцита в процесі розвитку ОКК шля хом об S2/s2 Відношення відношень К=(S2/s2)/(S1/s1) 3,885 17,505 2,326 2,851 2,758 1,278 8,778 12,855 2,669 6,196 5,007 1,348 12,916 6,301 6,379 6,665 5,587 3,060 2,747 2,516 Відношення площ числення додатково коефіцієнта К у порівнянні з контрольними (нестимульованими) дозрілими ОКК, що дозволяє взяти параметр К як об'єктивний критерій ефективності стимуляції розвитку ОКК. При цьому в якості зовнішньої дії може виступати будь-який вплив на ОКК - хімічний, фізичний або інший, що має за кінцеву мету стимулювати розвиток ОКК, результатом чого стає більш інтенсивне розростання кумулюса, що надає цьому критерію універсальний характер. Крім того, можна показати, що запропонований критерій виявляється математично більш строгим і чутливим, ніж звичайне відношення площ, що використано в прототипі, оскільки в запропонованому способі обчислюється відносний коефіцієнт К, який показує наявність або відсутність зовнішнього впливу на ОКК і напрям, в якому потрібно впливати на ОКК, щоб одержати стимуляцію розвитку, тобто з'являється можливість прогнозування дії зовнішнього впливу. 7 Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 38223 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601