Спосіб типування патогенних і непатогенних лістерій

Спосіб типування патогенних і непатогенних лістерій L monocytogenes, L innocua, I. gray», L ivanovn L seeligen, L welshimen що передбачає детекцію ампліконів, попередньо одержаних за допомогою полімеразної ланцюгової реакци, який відрізняється тим, що для полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери, що складаються з таких послідовностей Пропонуємий винахід відноситься до мікробіологи та молекулярної бюлопі, а саме до конструювання наборів лраймерів для міжвидового типування лістерій за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) Він може бути використаний для контролю мікробної контамінації харчових продуктів та визначення вида лістерій (L monocytogenes, L seeltgen, L »vanov»f, L gray», L innocua, L welshimen) Сучасні молекулярно-генетичні методи з використанням ПЛР дозволяють здійснювати не тільки виявлення інфекційних агентів, диференційну детекцію патогенних і непатогенних мікроорганізмів, а також проводити їх генотипування Генотипування патогенів має велике значення для охорони здоров'я людини Типування таких харчових патогенів як Listena або Salmonella за допомогою ПЛР має значно більшу ефективність, специфічність і чутливість і може надати істотно більше інформації у порівнянні з традиційними методами типування патогенів Метод ПЛР-генотипування базується на різниці між штамами у КІЛЬКОСТІ та розподілу відомих послідовностей ДНК або послідовностей, що повторюються, з використанням специфічних праймерів або характеристичних паттернів ампліфікації з праймерами випадкової ПОСЛІДОВНОСТІ Після розділення ампЛІКОНІВ у агарозному гелі ідентичні штами мають подібні характеристичні паттерни Такі молекулярні "відбитки пальців" є ефективним епідеміологічним інструментом ідентифікації і контролю мікроорганізмів Для міжвидового та внутрішньовидового типування лістерій використовують декілька молекулярно-бюлопчних методів Перша група базується на визначенні антигенних детермінант лістерій за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) з моноклональними антитілами До другої групи відносяться методи, що засновані иа аналізі геномної ДНК лістерій - лолімеразні ланцюгова реакція, а також поліморфізм довжини рестриктних фрагментів (ПДРФ) Існує спосіб детекци та диференційного виявлення лістерій, заснований на ПЛР-детекцн фрагмент/в гена іар який кодує білок рбО (Detection and differentiation of Listena spp by a single reaction based on multiplex PCR / A Bubert, I Hem, M Rauch, A Lehner et al // Appl Environ Microbiol 1999 - V 65, № 10 - P 4688-4692) Тест-систему складають 5 праймерів Один з них є спільним для чотирьох видів Listena Інші 4 праймери є специфічними для L monocytogenes, L innocua, L grayi та згрупова шх разом L ivanovn, L seeligen та L welshimen Недоліком цієї тест-системи є неможливість проводити диференційну детекцію L ivanovii, L seeligen та L welshimen Найбіпьш близьким до даної роботи є спосіб ідентифікації та диференціації штамів L monocytogenes за допомогою ПЛР та поліморфізме некодуючої ділянки гена hly (Single-strand conformation polymorphisms in the hly gene and poiymerase chain reaction analysis of a repeat region in the tap gene to identify and type Listena monocytogenes / M. Wagner, A. Lehner, D Klein, A Buber//J. Food Prot. List 5 5'- TTG ААА ТАТ ТТС АТТ ТСС САА GAG -З' List 6 5'- TGG ААА AAC TGA ТТТ АСС САА ТТТ А -З' List 7 5'- ТТА ССС ААС ТСС TGG АСА AAG - 3 і List 11 5'- ААА AAG ATT TGC GTG ТСС ТС -З' List 12 5'- CAT CAT GCA GTA ТТС GCA ААА СТТ -З' List 13 5' CGT GAA GTC АСА GCT AGT GG -3 1 List 14 5'- AAA TCA ТТС ТАС TGC АТС ААА AAG -3'. Ю CO oT 39715 - 2000. -V. 63, № 3. - P: 332-336). Проведений аналіз із 120 генетично різними штамами L. топоcytogenes дозволив виявити розподілення 14 типів паттернів, тобто варіантів L. monocytogenes. За допомогою ПЛР-амалізу гена, що кодує внутрішній повтор тріонін-аспарагін для білка рбО L. monocytogenes, було диференційовано 10 різних штамів L. monocytogenes. Недоліком даного способу є відносно невисока точність типування, оскільки результати типування за допомогою ПДРФ та ПЛР співпадають-у 70-80 % випадків. У більшості робіт з ПЛР-детекції інфекційних збудників автори створюють набори праймерів, виходячи зі знання послідовності тільки одного ізоляту. Це веде до того, що завдяки помилкам (неспареним нуклеотидам) у комплексі праймер-продукт для інших відомих ізолятів, за наявності двох та більше помилок, результат ПЛР-аналізу може бути помилково негативним В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу створити спосіб типування патогенних і непатогених лістерій шляхом конструювання наборів праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для забезпечення 100 % специфічності при проведенні ПЛР-аналізу. Термін "100 % специфічність" тут і далі означає, що для всіх відомих ізолятів (тобто для тих, які присутні у базах даних EMBL, GenBank, DDBJ) на момент проведення комп'ютерного аналізу ступінь гомології' дорівнює 100 %. В той же час є вірогідність, що існують варіанти лістерій, секвенс яких невідомо, або з часом буде секвеновано ізоляти генів лістерій, для яких ступінь гомології визначених нами фрагментів буде меншим, ніж 100%. В даній роботі розроблено дві тест-системи для генотипування лістерій. В основу першої покладено набори праймерів, комплементарних гену лістеріолізину (цитолізину), друга базується на праймерах, які комплементарні гену іар. Набір праймерів для генотипування лістерій складається з одного спільного праймера та де кількох праймерів, специфічних тільки до окремого вида лістерій. Перша тест-система дозволяє детектувати патогенні для людини лістерії L. monocytogenes, a також лістерії, що містять фактор патогенності, - L. ivanovii та L seeligeri. Тест-систему для ПЛР-детекції фрагмента гена лістеріолізину/цитолізину складено з чотирьох праймерів - одного спільного, консервативного 5'-кінця, праймера (List3) та трьох видоспецифічних праймерів (List5, List6, List7) Праймери сконструйовано таким чином, що генотипування усіх патогенних лістерій можливо провести в одній реакції з використанням мультиплексної ПЛР. ампліфіковані фрагменти для L. monocytogenes, L. ivanovii і L. seeligeri відрізняються довжиною ПЛРпродукту. Схема генотипування лістерій за допомогою ПЛР з набором праймерів до іар гена складається зі спільного праймера Listi та видоспецифічних праймерів Listi 1, List12, List13, List14, які дозволяють проводити генотипування L. grayi, L. іпnocua, L. welshimeri та L. seeligeri відповідно. Температури відпалу цих праймерів також підібрано таким чином, що типування лістерій за допомогою обох наборів праймерів можна проводити одночасно, в одній реакційній суміші, за допомогою мультиплексної ПЛР Проведений аналіз показав, що всі наші праймери не мають неспарених нуклеотидів у комплексі праймер-продукт, тобто характеризуються 100 %-им ступенем гомології, а отже і 100 %-ою специфічністю для всіх відомих ізолятів лістерій. Таким чином, сконструйовані набори праймерів дозволяють проводити за допомогою ПЛРаналізу типування 6 видів лістерій - L. monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua, L. grayi, L welshimeri, -із специфічністю, недосяжною для існуючих традиційних методів типування харчових патогенів. Приклад 1. Схема типування патогенних лістерій за допомогою ПЛР з праймерами до гена лістеріолізину/цитолізину. Набори праймерів Бактерія Llst3-Llst5 Результат аналізу Llst3-Llst7 Llst3-List6 Розмір ПЛРпродукту Результат аналізу Розмір ПЛРпродукту Lmonocytogenes Розмір ПЛРпродукту 378 + L ivanovii L. seeligeri Результат аналізу + 570 Розмір ПЛР-продукту наведено у парах основ. "+" - позитивний результат ПЛР-аналізу - наявність Listeria. "-" - негативний результат ПЛР-аналізу. 210 39715 Приклад 2. Схема генотипування лістерій за допомогою ПЛР з праймерами до гена іар Набори праймерів Бактерія L.innocua Llst1-List12 List1-Llst13 Llst1-Llst14 Розмір амплікона L.grayi Llst1-Llst11 Розмір амплікона Розмір амппікона Розмір амплікона 297 843 L welshimeri 434 Lseeligeri 561 Розмір ПЛР-продукту наведено у парах основ. "+" - позитивний результат ПЛР-аналізу - наявність Listeria. "-" - негативний результат ПЛР-аналізу. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3-72-89 (03122) 2-57-03