Спосіб визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин

СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ CTATJ ЕМБРІОНІВ СІЛЬСЬКОГОеПрДАРСЬКИХ ТВАРИН Пролонуемий винахід відноситься до молекулярної біолопї та бюіехнологп ВІН МОЖЄ 6УГИ ВИКОрИСТаНИЙ ПрИ розведенні ЦІННИХ порад СіЛЬСЬКОіОСІЮлар ських тварин, отриманні потомства бажаної статі. Існус спосіб пи-шачення статі ембріонів, заснований на полшеразній ланшо говій реакції (ПЛР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого скледасіься з 3 етапів: 1) денатурація досліджуємої нуклеїнової кислоти; 2) відпал лраймерш, тобто зв'язуванші олігонуклеотидів з комплементарними фрагментами нуклеїнової кислоти, що обмежують ампліфікуєму ділянку; 3) синтез ДНК, збільшення специфічних послідовностей до рівня виявлення. В залежності'від параметрів реакції та обладнання, тривалість циклу може варіювати в межах 4-6 хвилин, а число циклів, в залежності від кількості вихідного маТерііигу,- від ЗО до 50. Нл специфічність та чутливість ПЛР-аналізу значний вплйн чиня і ь декілька факторів: параметри ампліфікатору; пластиковий посуд, який використовується; дотримування певних заходів обережності при проведенні ПЛР; якість ПІДГОТОВКИ КЛІНІЧНОГО матеріалу; якість використовуємих тест-систем Якість тест-систем для ПЛР визначається якостю води, термостабільної ДИК-полімсрози, що використовуються, та "якостю" праймерів - ступенем гомолог і і" олігоНУКЛСОТИДШ, ЩО ВИІШрИСТОиуіОТЬСЯ. Ступень ГОМОДОІ Ії праЙМСрів с ключовим параметром, який визначає специфічність ПЛР. В 1959 p. Welshons W.J., Russell L.V. установили ЗВ'ІПОК між статтю тварини та наявністю чи відсутністю Y-хромосоми. В 1990 р. був клонований ген з Yхромосоми людини, який отримав назву SRY (sex determining region of Y gene область Y-хромосоми, відповідна за визначення сгаті). Згодом на трансгеннкх мишах був доказаний безпосередній зв'язок між SRY та чоловічою статтю тварини. Існує ПЛР-тест-система для визначення статі ембріона вівці через виявлення SRY-транскриптів (Characterization of ovine SRY transcript and developmental expression of genes involved in sexual differentiation / E. Fayen, E. Pailhoux, R A. Merhi et ai // Int.J.Dev.Biol. - 1996. - V. 40. - P. 567-57^). Існус також ПЛР-тест-система, що є найбільш близькою, ДІШ дстскіунаиня SRY у свині. Як зразок для ПЛР-аналізу, що досліджується, використовували геномну ДНК з лімфоцитів (Porcine SRY Gene Locus and Genital Ridge Expression /1. Daneau, J.-F. Ethier, S.G. Lussier and D.W. Silversidcs // Biology of Reproduction. - 1996. - V. 55. - P. 47-53). Недоліком тест-систем, що вказані, є недостатньо висока специфічність та шдсушіоть універсальності. В основу винаходу» що передбачається, поставлено завдання створити універсальну тест-систему Д-)ія визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин. Поставлена задача вирішується тим , що в способі визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин, що передбачає детектування SRY-транскриіггів, попередньо одержаних за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, Mf/fo 6«*>&z&g? для гюліме-разної ланцюгової реакції використовують праймери, що скидаються з таких послідовиостей: З'-САСССАТОААСОССТТСАТТОГОТСС -З' (SRY1), 5'ЧЇАСАСАССС ICC1CAAAGAAACCCGC-3' (SRY5). г Створення тест-системи для ПЛР-детекції SRY-гену передбачає пошук конссрвативних ділянок в ізолятах SRY-гену Y-хромосоми з високим ступенем гомології. Для комп'ютерного аналізу з наявних у базі даних GenBank (версія 99, ї 997 р.) секвенованих ізолятів SRY-гену різних тварин (європейського бізону, великої рогатої худоби, вівці, кози та свині) були обрані 6 фрагментів. Ділянки SRY-гену, що характеризувалися 100 % ступенем гомології, були обрані для подальшого аналізу та визначення системи праймерів. Враховуючи вимоги, які пред'являються до праймерів (близкість температур плавлення, зведення до мінімуму димерічації праймерів та наявності самокомплементарних ділянок у праймерів, а також деякі особливості первинної структури олігонуклеотидів, що можуть призводити до утворювання рівноважних вигинів у праймерів), нами була сконструйована пара праймерів для ПЛР-детекції SRY-гену, що дозволяє ампліфікувати фрагмент довжиною 160 пар олігонуклеотидів. Для відбору системи праймерів за їх термодинамічними характеристиками використовували програму "Oligo": "Оліго" (версії 3.4 та 5.0). Клінічним матеріалом для ПЛР були зразки периферичної крові з додатком антикоагулянту (0.056 М цитрат Na, 0.166 М глюкоза), а також фрагменти ембріонів великої рогатої худоби на стадії 60-120 клітин. Лейкоцитарну фракцію отримували центрифуїуванням у градієнті щільності 6 % фікол-15 % верографін (або тріомбраст) за 1500 g на протязі 20 хвилин. Препарати ДНК виділяли з лімфоцитів крові та ембріонів з використанням лізісу додецилсульфатом натрію з власними модифікаціями, а також за допомогою протеїнази К, Об'єм реакційної суміші для ПЛР дорівнював 50 мкл. Використовували два варіанти інкубаційної суміші. Приклад 1. "Біомайстер": 67 мМ тріс-НСІ рН 8.8, 17 мМ (NH^SO, , 0/01 % твін-20, 2.5 мМ MgCl2, 400 мкМ кожного з дезоксінуклеозидтрифосфатів, 0.1 мкМ кожного з праймерів, J-2 од. Taq-ДНК полімерази. Приклад 2. "Promega": 50 мМ КСІ, 10 мМ трис-НСІ рН 9.0, 0.1 % тритон Х-100, 2.5 мМ , MgCl2 , 200 мкМ кожного з дезоксінуклеозидтрифосфатів. Параметри реакції (температури плавлення продукту та праймерів) визначали за допомогою програми "Oligo" з врахуванням іонної сили інкубаційної суміші. ПЛР проводили на ампліфікаторі _НВО "Точність" (Росія). Кожний цикл ампліфікації включав денатурацію при 94 °С на протязі 1 хв., відпал при 66 °С 1.3 хв., синтез при 74 °С - 1 хв. Після 45 циклів ампліфікації відбирали 20 мкл проби для аналізу продуктів реакції у 1 % агарозному гелі (агароза DNA grade, Pharmacia). Електрофорез проводили за напруженістю електричного поля 10 В/см. Для фарбував* rejmft використовували бромістий етідій. ДНК фаіу X, оброблену рестри/стсадо^м Шг*& Ш та EcoRI, використовували як маркер молекулярної ъатъ ч в лімфоцити бика,- як ПОЗИТИВНИЙ контроль.