Спосіб отримання фракцій катехоламінів з біологічних тканин

1. Спосіб отримання фракцій катехоламінів з біологічних тканин шляхом екстракції висушеної та подрібненої тканини при підвищеній температурі, який відрізняється тим, що екстракцію проводять поетапно, екстрагуючи спочатку буфером з рН в межах фізіологічних значень при температурі 70°С та вище впродовж не менше 3-х годин, екстрагент вилучають, а потім проводять наступне екстрагування цього ж зразка кислотою до 2-х годин при температурі менше 70ºС. 2. Спосіб по п.1, який відрізняється тим, що межі фізіологічних значень екстрагенту відповідають рН тканини, яку екстрагують. Однак цей спосіб має такі недоліки: - Неможливість тривалого збереження вихідного матеріалу. - Спосіб екстракції та попередньої обробки передбачає вилучення тільки загального внутрішн Зоя (13) 41214 (11) UA ьоклітинного та позаклітинного вмісту катехоламінів. Відомий cпосіб одержання вільних амінокислот з тканин [2]. Біологічну тканину, з якої необхідно одержати вільні амінокислоти, висушують при температурі 60—70oC до постійної ваги. Надалі суху тканину подрібнюють та зважують. Наважку розміщують у ємкості для екстракції, приливають 0,1 М натрійфосфатний буфер з фізіологічним значенням рН, яке становить 7,4, та екстрагують у термостаті при температурі 70oC впродовж 2-х годин. Надалі екстракт змішують з рівним об’ємом 8% сульфосаліцилової кислоти для депротеінізації, центрифугують при 9000 об/хв 10 хв і отримують цільовий продукт у вигляді супернатанту, який вилучають для подальших потреб. Якщо проводять аналітичну процедуру, то його змішують з цитратним буфером рН 2,2 та проводять хроматографічне визначення вільних амінокислот тканини. Однак цей спосіб має такі недоліки: - Екстракція буфером дозволяє вилучити лише вільні-позаклітинні фракції амінокислот, в той час, як в тканинах присутні і внутрішньоклітинні фракції. - Час екстракції 2 години дозволяє вилучити лише ті біологічно-активні речовини, що добре розчиняються. В основу винаходу покладено завдання створити такий спосіб одержання фракцій катехоламінів, який би дозволив розділяти тканинний вміст катехоламінів на фракції за умов одного технологічного циклу, який передбачає дослідження (19) Винахід відноситься до біології та медицини, медичної хімії, до методів аналізу вмісту катехоламінів в біологічних субстратах і може бути використаний в науково-діагностичних цілях. Катехоламіни, будучи біологічно-активними речовинами, приймають участь в багатьох фізіологічних та патологічних процесах організму. При цьому ці процеси пов'язані з дією різних фракцій тих, що знаходяться позаклітинно в міжтканинній рідині, та тих, що знаходяться внутрішньоклітинно. В зв'язку з цим значно зросла увага до вивчення їх вмісту в різних біологічних субстратах та способів їх виявлення. Відомо, що значення рН різних тканин не є сталим, а коливається. Так, наприклад, еритроцити мають рН 7,21-7,26; дерма шкіри людини 7,47,6. Ці значення потрібно враховувати при екстрагуванні з тканини біологічно-активних речовин. Відомий "Спосіб визначення адреналіну та норадреналіну в тканинах флюориметричним методом" [1]. Біологічну тканину, в якій необхідно визначити катехоламіни, поміщують в пробірки, вносять 10-20 мг метабісульфіту натрія та 40-50 мг трилона Б, додають 10 мл HCІO4 та центрифугують 10 хв. при 3000 об/хв. Все це проводять при температурі 4oС . Центрифугат, що утворився, використовують для подальшого визначення катехоламінів. А ____________________ 41214 одного біологічного зразка. Це дає можливість аналізувати як загальний, так і внутрішньоклітинний та позаклітинний вміст катехоламінів та прискорити дослідження. Поставлена задача у прототипі реалізується шляхом екстрагування за технологічний цикл з одного зразка лише одного різновиду фракційного вмісту катехоламінів з тканини, причому без дотримання тканинного значення рН, з яким ця тканина існує. У способі, який заявляється, поставлена задача реалізується шляхом поетапного екстрагування катехоламінів з попередньо висушеної тканини спочатку буфером з рН в межах фізіологічних значень при температурі 70°С та вище впродовж не менше 3-х годин, екстрагент вилучають, а потім проводять наступне екстрагування цього ж зразка кислотою до 2-х годин при температурі менше 70°С, а також при дотриманні меж фізіологічних значень рН екстрагенту, які відповідають рН тканини. Проведені нами дослідження показали, що в тканинах наявні фракції, які виділяються буфером, та ті, що екстрагуються соляною кислотою. Катехоламіни, що екстрагуються буфером, ми називаємо позаклітинними і вонимістяться в міжклітинній рідині, а проекстраговані кислотою будуть становити загальний вміст. Отже, в тканинах є внутрішньоклітинні та позаклітинні фракції, сума яких становить загальний вміст катехоламінів. Проведені нами дослідження показали, що оптимальними параметрами при екстракції катехоламінів з висушеної тканини являються: за умови екстрагування буфером з рН, адекватним тканинному значенню, є температура 70°С та вище, а час екстракції не менше 3-х годин; за умови екстрагування соляною кислотою є температура нижче 70°С, наприклад, 60oС, а час екстракції до 2-х годин. Розроблений спосіб виконують наступним чином. Об'єкт дослідження, наприклад шкіру, висушують до постійної ваги. Роблять наважки по 100 мг, їх подрібнюють та вміщують в пробірки, додають по 3 мл фосфатного буферу з відповідним рН, закривають пробками та вміщують в термостат при температурі 70°С на 3 години. Після екстрагування екстракт вилучають для подальшого визначення вмісту катехоламінів відомим флюориметричним методом. Оцінюють позаклітинний вміст катехоламіну. Цю ж тканину повторно екстрагують, заливаючи 3 мл 0,1 N розчину соляної кислоти, при температурі 60°С до 2-х годин. Екстракт вилучають для подальшого визначення вмісту катехоламінів флюориметричним методом. Оцінюють внутрішньоклітинний вміст катехоламіну, а їх сума вказує на загальний вміст. Приклади виконання способу. Приклад 1. Об'єкт дослідження - шкіру, висушують до постійної ваги. Роблять наважки по 100 мг, їх подрібнюють та вміщують в пробірки, додають по 3 мл фосфатного буферу з рН 7,4, закривають пробками та вміщують в термостат при температурі 70°С на 3 години. Після екстрагування екстракт вилучають для подальшого визначення вмісту катехоламінів відомим флюориметричним методом. При екстракції позаклітинної фракції норадреналіну буфером його вміст становить 1,006 нг/мг тканини. Цю ж тканину повторно екстрагують, заливаючи 3 мл 0,1 N розчину соляної кислоти, при температурі 60°С впродовж 2-х годин. Екстракт вилучають для подальшого визначення вмісту катехоламінів флюориметричним методом. Внутрішньоклітинний вміст норадреналіну склав 0,086 нг/мг, а його загальний вміст - 1,092 нг/мг. Приклад 2. Об'єкт дослідження - еритроцити людини отримують із крові та висушують до постійної ваги. Роблять наважки по 100 мг, їх подрібнюють та вміщують в пробірки, додають по 3 мл фосфатного буферу з рН 7,2 , закривають пробками та вміщують в термостат при температурі 70°С на 3 години. Після екстрагування екстракт вилучають для подальшого визначення вмісту катехоламінів відомим флюориметричним методом. При цьому вміст адреналіну становить 0,25 нг/мг. Осад повторно екстрагують 3 мл 0,1 N соляної кислоти впродовж 1-ї години. В вилученому екстракті визначають внутрішньоклітинний вміст адреналіну, який склав 0,14 нг/мг. Загальний вміст адреналіну склав 0,39 нг/мг. Таким чином, розроблений нами спосіб має наступні переваги: 1. За один технологічний прийом дозволяє вилучити дві фізіологічні фракції катехоламінів позаклітинну та внутрішньоклітинну. 2.Екстракцію ведуть прийнятним екстрагентом, що приводить до отримання певних фракцій катехоламінів. 3.Використання буферу з рН, яке адекватнo тканинному, обумовлює вилучення саме біологічно-активних фракції, що приймають участь в обмінних процесах. 4. Спосіб дає можливість визначити 3 показники кількісного вмісту катехоламінів - позаклітинного, внутрішньоклітинного та загального. 5.В залежності від мети дозволяє проводити окреме визначення необхідної фракції катехоламінів. ЛІТЕРАТУРА 1. Меньшиков В.В. "Спосіб визначення адреналіну та норадреналіну в тканинах флюориметричним методом" /Методы клинической биохимии гормонов и медиаторов.// М., 1969/. 2. Мельниченко В., Михайличенко Б.В. "Спосіб одержання вільних амінокислот з тканин" /Патент РФ № 2063759 від 20 липня 1996 р./. 2 41214 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 3 41214 4