Спосіб фракціонування нітритвмісного біологічного матеріалу для визначення в ньому вмісту нітрогену

Спосіб фракціонування нітритвмісного біологічного матеріалу для визначення в ньому вмісту 3 42089 4 Таблиця 1 Концентрація Нітрогену амонію у вмісті рубця інкубованому із Na15NO2 і фіксації його етанолом або ТХО кислотою (n=5) Осаджувач Тривалість інкубації, хв. 0,5-1 120 0,5-1 120 ТХО кислота Етанол Дані таблиці 1 свідчать про те, що концентрація Нітрогену амонію на початку і в кінці інкубації у пробах фіксованих етанолом була меншою ніж при фіксації ТХО кислотою тобто, спостерігається втрата амонію із фіксованого вмісту рубця. Запропонований нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога тобто попереджує втрати амонію і запобігає при цьому створенню умов для неферментативного зв'язування білками нітритйонів, що дозволяє одержувати достовірну інформацію про інтенсивність перетворення нітрогеновмісних сполук у вмісті рубця жуйних тварин. В основу корисної моделі покладено завдання розробити ефективний спосіб фракціонування нітритвмісного біологічного матеріалу, при застосуванні якого не втрачається аміак і не протікає неферментативна взаємодія білків із нігрит-йонами. Технічний результат досягається завдяки тому, що фіксований етанолом нітритвмісний біологічний матеріал підкислюють до рН=5.0-5.5, а промивку осаду проводять 70%-вим етанолом підкисленим до рН=5.0. Концентрація Нітрогену, мМ 8,85±0,23 10,00±0,32 5,84±0,34 6,38±0,49 Таким чином, за рахунок підкислення фіксованого етанолом вмісту рубця до рН=5.0-5.5 і промивки осаду 70%-вим етанолом з рН=5.0 запропонований нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога і не створює умов для неферментативного зв'язування нітрит-йонів Найбільш повне осадження білків досягається при додаванні деяких кислот (трихлороцтової ТХО, хлорної та ін.) тому, що при цьому знижується рН і утворюються кислотонерозчинні солі [Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер: (перевод с англ. под ред. и с предисловием акад. А.А. Баева и д-ра хим. наук ЯМ. Варшавского) - М.: Мир, 1974 - С.155-157; Досон Р. Справочник биохимика /Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс (перевод с англ. канд. хим. наук В.Л. Друцы и канд. хим. наук О.Н. Королевой) - М.: Мир, 1991 - С.472-473]. Недолік використання кислот для осадження білків у нітритвмісному біологічному матеріалі полягає в тому, що за таких умов відбувається діазотування - неферментативне зв'язування нітритйонів з білками (табл. 2). Таблиця 2 Параметри Нітрогену білків у вмісті рубця інкубованому із Na15NO2 і його фіксації трихлороцтовою кислотою (n=5) Фракції Нітрогену Фіксатор Тривалість Інкубації, хв. білків ТХО кислота 0,5-1 120 Високе збагачення ізотопом l5N Нітрогену білків на початку інкубації (табл. 2) свідчить про неферментатавне зв'язування нітрит-йонів з білками тому є артефактом, а не свідченням використання Нітрогену нітритів для синтезу білків мікрорганізмами вмісту рубця. За фізико-хімічними параметрами вміст рубця можна представити як суспензію утворену протистами, бактеріями, залишками корму та злущеним епітелієм в поєднанні із ліофільною колоїдною системою утвореною водорозчинними білками у водному розчині органічних кислот, мінеральних солей та йонів амонію. Додавання етанолу викликає різні ефекти у різних субстратах, але в кінцевому підсумку все зводиться до обезводнення і денатурації молекул білка. Потім під впливом фізичних сил наступає їх агрегація та осадження, тобто розділення на фра Параметри Нітрогену білків збагачення ізотопом, концентрація, мМ ат.% 15N 9,56±0,76 1,14±0,09 8,51±0,26 1,10±0,04 кції високомолекулярних і низькомолекулярних сполук. При цьому фіксований вміст рубця має рН, яке характерне для нативного вмісту, тобто буде в межах 6,3-7,0. За цих умов не відбувається неферментативна взаємодія нітрит-йонів з аміногрупами на поверхні білків тому, що всі групи є практично зв'язанимиі, а рН не є оптимальним для діазотування. Оптимальним для цієї реакції є рН=2,7, яке створюється при використанні в якості осаджувача трихлороцтової кислоти. В той же час у вмісті рубця фіксованому етанолом рН таке саме як і в нативному вмісті тому внаслідок леткості амонію спостерігається його втрата. При фракціонуванні силосів амоній не втрачається тому, що їх рН знаходиться в межах 3,8-4,2. Отже, підкислюючи нітритвмісний біологічний матеріал до рН=5,0-5,5 і промиваючи його 5 42089 підкисленим етанолом ми запобігаємо втратам амонію і не створюємо умов для діазотування. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником знайдено технічне рішення, яке містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим способом (Сергеев В.М. Определение аммиака, амидного,аминного и нитратного азота в экстрактах силоса и консервированных кормов //В кн.: Новые методы и модификации биохимических исследований в животноводстве (Методическое руководство) - М: Колос, 1970. - С.77-82): нітритвмісний біологічний матеріал фіксують 96%-вим етанолом, осад чотирикратно промивають 70%-вим етанолом, а всі надосадові об'єднують. Однак, наявність зазначених, спільних з найближчий аналог ознак, недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. В патентній і науково-технічній літературі не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від найближчого аналога і забезпечують досягнення технічного результату тільки шляхом підкислення нітритвмісного біологічного матеріалу до рН=5.0-5.5 та чотирикратну промивку осаду етанолом підкисленим до рН=5.0. Корисна модель може бути застосована в аналітичних лабораторіях з різними формами власності та науково-дослідних установах, які вивчають перетворення нітрат-нітритів у біологічних об'єктах. Вона є практично незамінною у дослідженнях з використанням сполук мічених 15N, а тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність". Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: 1. Готують 3,0%-вий розчин H2SO4 в 70%-вому етанолі. 6 2. Вносять в центрифужні пробірки 96%-вий етанол із розрахунку на 70%-ву кінцеву концентрацію. 3. Вносять досліджуваний вміст рубця в центрифужні пробірки з 96%-вим етанолом, перемішують і підкислюють 3,0%-вою H2SO4 в 70%вому етанолі. 4. Центрифугують 30 хвилин при 3000об/хв і декантують надосадову із кожної пробірки в окрему колбу. 5. Заливають осад 70%-вим етанолом підкисленим до рН=5,0, розмішують скляними паличками, центрифугують 30 хвилин при 3000об/хв, декантують надосадову до першої порції відповідної проби. Повторюють процедури чотири рази. 6. Мінералізують промитий осад і використовують для визначення концентрації Нітрогену білків; надосадову використовують для визначення концентрації Нітрогену спирторозчинних сполук різних класів, зокрема амонію. Ефективність заявленого способу, його переваги перед найближчим аналогом, підтверджені прикладами конкретного виконання способу. Для цього, в умовах Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького проведено інкубування вмісту рубця із Na15NO2. Одну частину інкубованого вмісту фракціоновано за прописом найближчого аналога, другу частину - за прописом пропонованого способу. Після розділення вмісту на фракції з них виділяли Нітроген амонію та білків і визначали його концентрацію та збагаченням 15N. Крім того, із третьої частини інкубованого вмісту рубця виділяли аміак класичним (мікродифузійним) методом [Белозерский А.Н. Практическое руководство по биохимии растений /А.Н. Белозерский, Н.И. Проскуряков - М.: Сов. Наука, 1951 С.106-137] без фракціонування з наступним визначенням концентрації та збагачення його Нітрогену 15N (табл. 3). Таблиця 3 Параметри Нітрогену амонію та білків виділеного різними методами із вмісту рубця інкубованого із Na15NO2 (n=5) Метод визначення Фракції Нітро- Тривалість Інкугену бації, хв. з фракціонуванням вмісту рубця за найближчий аналогом амонію з фракціонуванням вмісту рубця за пропонованим способом амонію мікродифузійний метод амонію білків білків 0,5-1 120 0,5-1 120 0,5-1 120 0,5-1 120 0,5-1 120 Аналіз даних таблиці 3 свідчить про те, що концентрація Нітрогену амонію визначена класичним методом і з використанням пропонованого способу фракціонування вмісту рубця виявилася Параметри Нітрогену збагачення ізотопом, концентрація, мМ ат.% 15N 8,20±2,08 0,29±0,04 8,36±2,35 2,92±0,61 23,96±2,26 0.08±0,02 22,63±2,96 0,67±0,0,04 11,30±2,14 0,32±0,04 11,80±2,72 2,97±0,65 23,08±2,22 0,09±0,02 21,52±3,00 0,69±0,05 11,18±2,20 0,33±0,04 11,96±2,62 2,96±0,48 практично однаковою, а збагачення Нітрогену білків 15N на початку інкубації вказує на відсутність неферментативного зв'язування нітрит-йонів. 7 42089 Таким чином, заявлений спосіб фракціонування нітритвмісного біологічного матеріалу запобігає Комп’ютерна верстка О. Рябко 8 втратам аміаку і не створює умов для неферментативного зв'язування нітрит-йонів. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601