Спосіб визначення серотоніну та мелатоніну в одній пробі біологічного матеріалу

Спосіб визначення серотоніну та мелатоніну в одній пробі біологічного матеріалу шляхом проведення оптичного аналізу проби, який відрізняється тим, що проводять виборчу екстракцію мелатоніну та серотоніну діетиловим ефіром та соляною кислотою з подальшою спектрофлюорометрією. Корисна модель стосується медицини, а саме нормальної фізіології та біохімії і може бути застосована в клінічній лабораторній діагностиці. Проблема визначення мелатоніну та серотоніну є актуальною для експериментальної' та клінічної медицини. Визначення концентрації цих гормонів необхідно для діагностики таких важких захворювань, як злоякісні новоутворення, імунодефіцити, цукровий діабет, нейро-дегенеративна патологія. На жаль, на цей час немає достатньо ефективного, інформативного та універсального методу визначення цих гормонів в біологічному матеріалі. Тому розробка нової методики визначення мелатоніну та серотоніну в одній пробі є актуальним питанням сучасної медицини І викликає необхідність приділити увагу розробці такого способу. визначити гормони - похідні індолу - серотоніну та мелатоніну в одній пробі біологічного матеріалу, та не дозволяє кількісно визначити вміст мелатоніну. Найбільш близьким за технічною сутністю та результатами, що досягаються, є спосіб, який полягає в розподілі серотоніну та мелатоніну на тонкому шару сорбенту з подальшою спектрофотометрією забарвлених комплексів гормонів з алоксаном [Патент №51446, Україна, МПК G01 N33/00. Спосіб визначення гормонів похідних індолу та їх метаболітів в одній пробі біологічного матеріалу // Промислова власність. - 2002. - № 1 1 . С.4.179.]. Прототип та спосіб, що заявляється, мають такі спільні суттєві ознаки: Проведення оптичного аналізу Але спосіб-прототип є недостатньо ефективним, тому що не дозволяє визначати концентрації гормонів нижче 10 6 М, потребує тривалого часу для проведення, виникають розбіжності при кількісному визначенні у період хроматографування. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення серотоніну і мелатоніну в одній пробі біологічного матеріалу шляхом використання екстракційноспектрофлюорометричного методу, що дозволяє підвищити чутливість та спростити методику визначення. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає проведення оптичного аналізу проби, новим є те, що проводять виборчу екстракцію мелатоніну та серотоніну діетиловим ефі Аналогом є хроматографічний метод визначення мелатоніну [Opienska-Klant S., Kraezhowski М. The method of melatonm definition // J. Chromatogr. - 1985. - Vol.17, №11, - p.228-238], який полягає у проведенні хроматографічного дослідження, при якому використовують вихідну тонкошарову хроматографію на силуфолових платівках, з подальшою денситометрією плям мелатоніну та триптофану. Спільними суттєвими ознаками аналогу и корисної моделі, що заявляється, є: - визначення мелатоніну та його прекурсора триптофану; - застосування хроматографічного методу дослідження. Цей метод не є достатньо ефективним, тому що не дозволяє диференційовано розподілити та 5 6147 ром та соляною кислотою з подальшою спектрофлюорометрією. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому: - Застосування виборчої екстракції мелатоніну та серотоніну діетиловим ефіром та соляною кислотою в одній пробі біологічного матеріалу дозволяє селективне виділяти дані сполуки з біологічного матеріалу. - Використання спектрофлюорометрії суттєво підвищує мінімум серотоніну та мелатоніну, що відкривається, в біологічному матеріалі (10~71 10" *М) - Спосіб дозволяє визначати сполуки з матеріалу, здобуття якого не потребує інвазивних методів (слина, сеча, сльоза). - Для визначення сполук достатньо невеликої кількості біологічного матеріалу (0,01-1мкл). Спосіб здійснюють таким чином. Мелатонін та серотонін екстрагують соляною кислотою та діетиловим ефіром. До ефірного екстракту додають соляну кислоту та після центрифугування в кислій фазі визначають серотонін з реакції з нингідрином, а в етиловій фракції визначають мелатонін з реакції з ортофталевим ангідридом. Кількісне визначення мепатоніну та серотоніну проводять спектрофлюорометрично. Приклад. До 0,1 мл сироватки, сечі або гомогенату тканини добавляють 3,0мл бідистильованої води та 5,0мл ефіру, струшують 5 хвилин (операцію повторюють тричі). Визначення серотоніну. До отриманого розчину добавляють 2мл 0,5М фосфатного буферу Комп'ютерна верстка В. Мацело (рН7,0) та струшують 5хв. Центрифугують 5хв. при ЮООоб/хв. Водну фазу кількісно відбирають. До ефірного екстракту добавляють 3,0мл 0,1 н НСІ та струшують 5хв., центрифугують 10хв. при 1500об/хв. та відбирають кислу фазу. В кислій фазі визначають серотонін, завдяки додаванню 1,0мл кислої фази та 1,0мл 0,1 М фосфатного буферу (рН8,0) і 0,2мл 0,1М нинпдрину. Інкубують 30хв. при 75°С, охолоджують. Через 1 час спектрофлюорометрують при хвилі збудження 360 нм та хвилі флюоресценції 480нм. Визначення мелатоніну. 5,0мл ефірного екстракту двічі відмивають бідистильованою водою. Центрифугують при 1500об/хв Водну фазу відбирають. Ефірний екстракт випаровують у плоскодонних колбах при 145°С, осадок розчиняють в 2,5мл 5н НСІ та додають 1,0мл 0 , 1 % розчину ортофталевого ангідриду на метанолі та 1мл Юн НС1. Кип'ятять на водяній бані 10хв., охолоджують. Через 30хв. спектрофлюориметрують при хвилі збудження ЗбОнм та хвилі флюоресценції 480нм. Концентрацію гормону розраховують за формулою: DoCoN De a де Do - оптична щільність стандартного розчину Co - концентрація стандартного зразка N - розчин De - оптична щільність експериментального зразка а - об'єм біологічного матеріалу. Підписне Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власностГ, вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601