Спосіб визначення адреналіну та норадреналіну в одній пробі біологічного матеріалу

Спосіб визначення адреналіну та норадреналіну в одній пробі біологічного матеріалу шляхом вибірної екстракції цих гормонів, окиснення їх та проведення оптичного аналізу, який відрізняється тим, що екстракцію проводять соляною кислотою, адсорбують гормони гідрооксидом алюмінію, змінюючи рН середовища, з подальшим проведенням спектрофлюорометрії в гідроксиді натрію окиснених та стабілізованих аскорбіновою кислотою адреналіну і норадренапіну. Корисна модель стосується медицини, а саме нормальної фізіології та біохімії, і може бути застосована в науково-дослідній та клінічній лабораторній діагностиці. Проблема визначення адреналіну і норадреналіну є актуальною для експериментальної та клінічної медицини. Визначення концентрації цих гормонів необхідно для діагностики таких важких захворювань, як феохромоцитома артеріальна гіпертензія, патологія центральної нервової системи. На жаль, на цей час немає достатньо ефективного, Інформативного та універсального методу визначення цих гормонів в біологічному матеріалі. Тому розробка нової методики визначення адреналіну та норадреналіну в одній пробі є актуальним питанням сучасної медицини і викликає необхідність приділити увагу розробці такого способу. Аналогом є хроматографічний метод визначення адреналіну та норадреналіну на тонкому шарі сорбенту [Шаршунова М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии." Прага.- 1980.- 346с], який полягає у проведенні хроматографічного дослідження, при якому використовують вихідну тонкошарову хроматографію Після розподілу норадреналіну і адреналіну на платівках "Силуфол" визначали наявність гормонів в УФ-випромінюванні. Кількісну оцінку вмісту адреналіну та норадреналіну визначали спектрофотометричним методом після окиснювання йодом. Спільними суттєвими ознаками аналога і корисної моделі, що заявляється, є такі: - застосування хроматографічного методу дослідження. Цей спосіб не є достатньо ефективним, тому що не виключає втрат адреналіну та норадреналіну при хроматографу ванні, є трудомістким, потребує спеціального обладнання. Найбільш близьким за технічною сутністю та результатами, що досягаються, є спосіб, який полягає у визначенні адреналіну та норадреналіну методом колоночної хроматографії на окисі алюмінію з подальшою флюорометрією окиснювальних комплексів гормонів з йодом [Меньшиков В.В Лабораторные методы исследования в клинике. М. - Медицина, 1987. - 368с]. Прототип та спосіб, що пропонується, мають такі спільні суттєві ознаки: - виборча екстракція речовин; - поведения оптичного аналізу; - застосування окиснювальних агентів. Але спосіб-прототип є недостатньо ефективним, тому що не дозволяє визначати адреналін та норадреналін в сироватці та тканинах, має втрати гормонів при хроматографій на колонках, процес визначення довготривалий та потребує спеціального обладнання. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення адреналіну та норадреналіну в одній пробі біологічного матеріалу шляхом використання адсорбцюнно 11450 хвиля збудження 410нн Для рН 6,4 спектрофлюорометричного методу, що забезпехвиля випромінювання 485нм чить підвищення чутливості, якості визначення визначаємо адреналін В буфері рН 3,5 гормонів та спрощення методики. сума адреналін + норадреналін В буфері рН 6,4 Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає вибірну екстракцію адренаDo ліну та норадреналіну, проведення оптичного анаде Do - оптична щільність стандартного розлізу окиснювальних комплексів, новим є те, що чину проводять екстракцію соляною кислотою та вибоCo - концентрація стандартного зразка 5-Ю 7 рчу адсорбцію адреналіну і норадреналіну гідроDe - оптична щільність експериментального оксидом алюмінію, змінюючи рН середовища, з зразка подальшою спектрофлюорометрією в гідрооксиді N - розчин натрію окиснених продуктів катехоламінів фероціРезультат в нмоль/л анідом калію та стабілізованих аскорбіновою кисПриклад 2 лотою. Визначення адреналіну та норадреналіну в Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю гомогенатах тканин. Точну навіску гомогенату ткаознак, що заявляються, та технічним результатом нини, одержану в рідкому азоті (або в льодяному полягає у такому 0,15М КСІ) кладуть в 0,4н НСІО4 в співвідношенні - застосування виборчої адсорбції адреналіну 1:10 та приміщують в холодильник при +5"С на ЗО та норадреналіну на гідрооксиді алюмінію в лужхвилин. Після цього центрифугують при 3000об/хв. ному середовищі в одній проби біологічного матепротягом 20 хвилин. ріалу дозволяє селективно виділяти дані сполуки з Надосадну рідину нейтралізують до рН 8,0-8,2 біологічного матеріалу; 5М К2СО3 по фенолфталеїну 0,5мл надосада змі- спосіб, що пропонується, дозволяє визначати шують з 1 мл гідрооксиду алюмінію (гідрооксид сполуки в тканинах та сироватці крові; алюмінію приготовляють з 25гр. алюмокалієвих Для визначення сполук достатньо невеликої галунів в 200мл води при нагріванні, після чого по кількості біологічного матеріалу (0,01-1мкл); краплинам додають 20мл 25% КОН Осад проми- використання стабілізуючого розчину дозвовають водою. Відстоюють. Воду зливають, ретеляє більш достеменно визначати концентрацію льно перемішують та відстоюють 10 хвилин норадреналіну. (t°+5°C). Центрифугують при 1000об/хв. протягом Спосіб здійснюють таким чином: 10 хвилин, надосад зливають, а до осаду додають Адреналін та норадреналін екстрагують хлорЗмл 0,25н оцтової кислоти або 0,4н НСІ перемішуною кислотою доводячи розчин до рН 2,0. Нейтрають та відстоюють 10 хвилин t°+5°C. Центрифугулізований до рН 8,0-8,2 екстракт адсорбують на ють при 1000об/хв. протягом 10хв. За необхідністю гідрооксиді алюмінію та після центрифугування до додають 1 лакмо 1н NH4OH). осадку додають 0,4н соляну кислоту Після цього в З елюату відбирають дві порції по 0,5мл. Кожсолянокисному елюаті при різних рН 3,5 та 6,4 ну частину змішують з 0,15М фосфатним буфером шляхом окиснювання фероціанідом калію, та нарН 3,5 та 0.15М фосфатним буфером рН 6,4 по дання як стабілізуючої речовини розчину аскорбі1,5мл і додають 0,1 мл 0,25% розчину фероціаніду нової кислоти, визначають кількість адреналіну та калію. Рівно через 4 хвилини додають 1,0мл 0,2% норадреналіну спектрофлюорометричним меторозчину аскорбінової кислоти. Після чого доводять дом. бідистилятом до 3-4мл. Штатив з пробірками на 5 Приклад 1 хвилин ставлять в морозильну камеру (t° (-2°) - (Визначення адреналіну та норадреналіну в 4°)С). Під час вимірювання проби знаходяться на слині або сироватці крові 1мл слини, або 0,1мл холодовій бані сироватки крові змішують з 0,01 н НСІ в співвіднохвиля збудження 410нм хвиля випромінювання 505нм шенні 1:1 та центрифугують при 7000об/хв протяВ буфері рМ 3,5 визначаємо адреналін гом ЗО хвилин при t°+2°C. Отриманий супернатант В буфері рМ 6,4 сума адреналін + норадреналін використовують для біохімічних досліджень, попеDeCoN редньо розподіливши його на 2 рівні частини. Doa До кожної частини, змішавши відповідно с де Do - оптична щільність стандартного роз1,5мл буферу рН 3,5 і рН 6,4, додають 0,1мл чину 0,25% розчину фероціаніду калію. Рівно через 4 Co - концентрація стандартного зразка 5-10 7 М хвилини додають 1,0мл 0,2% розчину аскорбінової De - оптична щільність експериментального кислоти. Через 3 хвилини об'єм в усіх пробірках зразка доводять бідистилятом до 3,0мл. Штатив з пробірN - розчин ками на 5 хвилин ставлять в морозильну камеру а - вага біологічного матеріалу в грамах ре