Спосіб визначення кислих і основних білків у лейкоцитах біологічного матеріалу

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до фізіології та клінічної медицини. Відомий спосіб визначення кислих та основних білків у гістологічних препаратах з використанням бромфенолового синього за Мікель-Кальво, який прийнятий за аналог (А.И. Кононский Гистохимия. М.: Высшая школа, 1976, С.104.), який складається з взяття біологічного матеріалу, приготування зрізів, фіксації у формаліні (одну добу), депарафіювання, проводки у понижуючих концентраціях етанолу, фарбування 2-10 хвилин розчином 0,1%-ного бромфенолового синього в суміші 96%-ного етанолу (7 частин) та крижаної оцтової кислоти (3 частини) (рН2,4), диференціювання в 1%-ному спиртовому розчині оцтової кислоти, проводки в зростаючих концентраціях етанолу, просвітлення у ксилолі, поміщення в канадський бальзам чи полістирол, мікроскопічного дослідження. Ознаками, спільними з ознаками заявленого способу, є: взяття біологічного матеріалу, фіксація, фарбування у 0,1% розчині бромфенолового синього в суміші 96%-ного етанолу та крижаної оцтової кислоти, мікроскопічне дослідження. Недоліками цього методу є: фіксація в рідких фіксаторах, що спотворювала структур у і форму клітин, тривалий час приготування препаратів. Відомий спосіб визначення катіонного білка в лейкоцитах бромфеноловим синім, який прийнятий за прототип (Лабораторные методы исследования в клинике/ Под ред. проф. В.В. Меньшикова. - М. ”Медицина”, 1987, С.134.), який складається з взяття крові, приготування мазків, фіксації сульфосаліциловою кислотою, промивання в дистильованій воді, фарбування розчином бромфенолового синього в боратному буфері, промивання в боратному буфері, фарбування сафраніном, мікроскопічне дослідження. Ознаки, спільні з ознаками заявленого способу: взяття біологічного матеріалу, приготування препаратів, фіксація, фарбування, мікроскопічне дослідження. Недоліки: не дозволяє оцінити аніонні білки, фіксація в сульфосаліциловій кислоті погано зберігає структур у клітин. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб визначення кислих і основних білків у лейкоцитах біологічного матеріалу, який шляхом фіксації та фарбування лейкоцитів дозволяє одержувати стабільні результати, дає можливість кількісної оцінки змісту білка в гранулах лейкоцитів, і на підставі мікроскопічного дослідження та підрахунку кількості кислих і основних білків, що локалізуються в гранулах різних типів лейкоцитів і/або морфологічної оцінки характеру гранул та їхнього розподілу дозволяє оцінювати функціональну повноцінність лейкоцитарного ростка, систематизувати і дати оцінку стан у людини в нормі і патології. Суттєвими ознаками винаходу є: взяття біологічного матеріалу, приготування мазків або зліпків, фіксація в парах формаліну від 30 хвилин до 3 днів, промивка в чистому н-бутанолі протягом 1-3 хвилин, фарбування розчином 0,1%-ного бромфенолового синього в суміші 96%-ного етанолу (5 частин), діоксану (4 частини) та крижаної оцтової кислоти (1 частина) протягом 2-5 годин, промивка в чистому н-бутанолі 1-3 хвилини, мікроскопічне дослідження. Відмінними від прототипу ознаками є: фіксація в парах формаліну від 30 хвилин до 3 діб, промивка в нбутанолі 1-3 хвилини, фарбування 1-2 години 0,1%-ним розчином бромфенолового синього в суміші 96%-ного етанолу (5 частин), діоксану (4 частини) та крижаної оцтової кислоти (1 частина), промивка в н-бутанолі протягом 1-3 хвилини та підрахунок кількості кислих і основних білків, що локалізуються в гранулах різних типів лейкоцитів і/або морфологічної оцінки характеру гранул та їхнього розподілу. Саме використання н-бутанолу, як розчину для промивки, дозволяє одержати чітку структуру клітин і чітке виявлення білків у гранулах лейкоцитів, а комплексне використання парів формаліну і фарбування розчином бромфенолового синього в суміші 96%-ного н-бутанолу, діоксану та крижаної оцтової кислоти - одержати відтворюючі результати при фарбуванні і надає можливість кількісної цитохімічної оцінки змісту білка в гранулах лейкоцитів. Спосіб здійснюють таким чином. Беруть біологічний матеріал та готують мазки або зліпки. Свіжоприготовані мазки або зліпки, що зберігалися не більше 2 діб з моменту взяття, фіксують у парах нейтрального формаліну від 30 хвилин до 3-х діб та витримують при кімнатній температурі до зникнення запаху формаліну. Мазки або зліпки промивають у н-бутанолі 1-3 хвилини. Після чого фарбують 2-5 години розчином, який містить, 96%-ний етанол - 5 частин, діоксан - 5 частин, крижану оцтову кислоту - 1 частину, бромфеноловий синій 10мг на 100мл отриманого розчину. Розчин повинен бути прозорим і мати світло-червоний колір. Після фарбування мазки або зліпки промивають в н-бутанолі протягом 1-3 хвилин. На препаратах основні білки, що містяться в лейкоцитах, зафарбовуються в синій колір (від світло- до темно-синього), а кислі білки в рожево-бордовий. Мембрани клітин чітко диференціюються, цитоплазма клітин є оптично прозорою, білок зафарбовуються в колір різної інтенсивності залежно від концентрації і локалізації в гранулах лейкоцитів, виявляються цитоплазматичні включення і структурні зміни (вакуолізація і т.п.). Підрахунок кількості кислих і основних білків, що локалізуються в гранулах різних типів лейкоцитів і/або морфологічної оцінки характеру гранул та їхнього розподілу роблять при аналізі не менш ніж на 100 клітин. Підрахунок роблять у тій частині мазка, в якій клітини розташовані в один шар, і чітко видно двояковигнутість еритроцитів. Приклад конкретного виконання. Брали кров з пальця людини та готували мазки. Свіжоприготовані мазки крові фіксували у парах нейтрального формаліну 30 хвилин та витримали при кімнатній температурі до зникнення запаху формаліну. Мазки промивали у н-бутанолі 2 хвилини. Після чого фарбували 2-5 годин розчином, приготовленим таким чином. Змішували 96%-ний етанол - 5 частин, діоксан - 5 частин, крижану оцтову кислоту - 1 частину, бромфеноловий синій 10мг на 100мл отриманого розчину. Після фарбування мазки промивали в н-бутанолі протягом 2 хвилин та висушували. Після цього проводили мікроскопічне дослідження. Виявлено: середній вміст гранул нейтрофілів 145±5,4 основних гранул, 5±1,2 кислих гранул. Дані дозволили зробити висновок про проведення терапії. Порівняльний аналіз заявленого способу з прототипом показує, що заявлений спосіб відрізняється від попереднього більш високою точністю, доступністю і дозволяє виявляти кислі та основні гранули лейкоцитів на мазках та зліпках. Таким чином, заявлений спосіб може використовуватися для підрахунку кількості кислих і основних білків, що локалізуються в гранулах різних типів лейкоцитів і/або морфологічної оцінки характеру гранул та їхнього розподілу, що дозволяє дати повну оцінку стану лейкоцитарного ростка людини в нормі та при патологічних станах. Рішення відповідає всім критеріям запропонованого винаходу.