Спосіб визначення онкологічного маркеру в сироватці крові

Спосіб визначення онкологічного маркеру в сироватці крові, шляхом дослідження сполучення її з діагностикумом, відрізняючийся тим, що досліджують суміш "сироватка крові – цитостатик" і при появленні у цієї суміші вільних небілкових SH-груп констатують онкологічний маркер. (19) (21) 98052364 (22) 07.05.1998 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Костюшов Володимир Васильович, Костюшова Лілія Антонівна, Костюшова Наталія Володимирівна, Тимчишин Олег Львович, Морозкін Володимир Васильович 30435 Поставлена задача вирішується тим, що згідно з винаходом, досліджують суміш "сироватка крові – цитостатик", і при появі у цієї суміші вільних небілкових SH-груп констатують онкологічний маркер. Аналіз технічного рішення, що пропонується, дозволив виявити такі відзнаки: - сполучення in vitro сироватки крові з цитостатиком для визначення специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком; - визначення вільних небілкових SH-груп у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик. Запропонована сукупність ознак дозволяє забезпечити чутливість і специфічність способу, досягнути його універсальності в плані визначення специфічного зв'язування білків сироватки крові з різноманітними цитостатиками (вінбластин, вінкристин, циклофосфан та ін.), а також обгрунтувати необхідність застосування цитостатичноі терапії. Відомий спосіб визначення специфічного зв'язування раково-ембріонального антигену (СЕА) з раково-ембріональними антитілами (Anti-CEA) методом імунофлюоресцентного аналізу, але невідомий спосіб визначення специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком по визначенню вільних небілкових SH-груп в реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик. Відомий спосіб визначення вільних небілкових SH-груп в еритроцитах, лейкоцитах, сироватці крові, наприклад, для визначення захворювань крові, інфарктів внутрішніх органів та ін., але невідомо визначення вільних небілкових SH-груп у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик. Автори виходили з того, що унікальна властивість білків специфічно зв'язувати різноманітні за своєю природою речовини пов'язана з пошкодженням білкової молекули та з її денатураційними перетвореннями (Адо А.Д. Вопросы общей нозологии. - М: Медицина, 1985. - С. 7). Денатураційні перетворення білкових молекул супроводжуються суп утніми молекулярними реакціями, і, зокрема, підвищенням реакційної спроможності різноманітних функціональних груп, в тому числі і дисульфідних груп (Белицер В.А. // Укр. биохим. журн., 1962. - Т. 24, В. 2. - С. 290-320). Відомо, що реагувати можуть тільки молекули або їхні фрагменти, які мають структурну комплементарність, що і з умовлює специфічне зв'язування молекул (Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Л. Йегер - М.: Медицина,1990. С. 134). До факторів специфічного зв'язування молекул відносяться сили Ван-дер-Ваальса, вод- неві і ковалентні зв'язки, в тому числі і дісульфідні зв'яз- ки (Клиническая иммунология и алергологія / Под ред. Л. Йегер - М.: Медицина, 1990. - С. 134). В молекулярному аспекті денатураційні перетворення білків характеризуються порушенням міцності зв'язку між поліпептидами і порушенням просторової конфігурації та упорядкованості макроструктури білків (Жоли М. Физическая химия денатурации белков. - М., 1968. - С. 3-21). Вони супроводжуються відновленням білкових дисульфідних зв'язків, в тому числі змішаних дісульфідних зв'язків з небілковими тіолами та появою вільних SH-груп, які активують так звану реакцію тіолдісульфідного обміну (Белицер В.А. // Укр. биохим. журн. - 1962. - Т. 24, в. 2. - с. 290-320). В літературі не містяться дані відносно порушення міцності змішаного дісульфідного зв'язку між небілковими тіолами та білком в процесі його специфічного зв'язування з цитостатиком. Автори також не виявили відомостей відносно появи у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик вільних небілкових SH-груп. Застосування цього феномену для визначення специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком у літературі не описане. Встановлено, що у сироватці крові здорових та хворих людей вільні небілкові SH-групи не визначаються (Капланский С.Я., Азявчик А.В. // Вопр. мед. хим. - 1962. - Т. 8, № 1. - С. 53-58). Це пояснюється тим, що небілкові SH-групи знаходяться у сироватці крові в зв'язаному з білком стані. Дані літератури вказують, що факт утворення змішаних дісульфідних комплексів між білками та небілковими тіолами, наприклад, глута тіоном, грають важливу роль в регулюванні структури білкових молекул (Modig H. // J. Biochem. - 1966. - 60 – v. 5. P. 496). При розробці запропонованого способу авторивиходили з припущення, згідно з яким поява вільних небілкових SH-груп в реакційній суміші: сіроватка крові+цитостатик виникає в результаті денатураційних перетворень білкових молекул. Тому специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком супроводжується відновленням змішаних дісульфідних зв'язків. При такому пошкодженні білкових молекул, в результаті відновлення змішаних дісульфідних зв'язків між ними та небілковими тіолами в реакційній суміші: сироватка крови+цитостатик з'являються вільні небілкові SHгрупи. Сутність способу полягає в тому, що in vitro з'єднують сироватку крові пацієнта з цитостатиком (наприклад, вінбластином, вінкристином, циклофосфаном та ін.) в співвідношенні 9:1. Далі здійснюють термостатування такої реакційної суміші при температурі 37°С протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик визначають вільні небілкові SH-групи методом амперометричного титрування (АМТ) (патент № 20935 A UA, МКБ А61В10/00, G01N27/06, пуб. 07.10.1997). Їх поява свідчить про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком, а відсутність вільних небілкових SH-груп в означеній реакційній суміші свідчить про те, що специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком не відбулося. Для створення оптимального стеохімічного співвідношення між структурами білків сироватки крові, що реагують з цитостатиками, авторами досвідченим шляхом обране співвідношення, що склало, відповідно, 9:1. При розробці запропонованого способу, автори виходили з отриманих даних, згідно з якими у хворих з пухлинними (злоякісними) патологічними процесами (рак, гемобластоз, лімфома та ін.) при сполученні in vitro сироватки крові з цитостатиком (наприклад, вінбластин, вінкристин, циклофосфан та ін.) в співвідношенні 9:1, в отриманій реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик з'являються вільні небілкові SH-групи. Також було встановлено, що у здорових осіб та у хворих, захворювання яких не було зумовлене 2 30435 пухлинними (злоякісними) патологічними процесами, при сполученні in vitro сироватки крові з цитостатиком (наприклад, вінбластин, вінкристин, циклофосфан та ін.) у співвідношенні 9:1, у отриманій реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик не визначалися вільні небілкові SH-групи. Зазначене вище і з'явилося передумовою для вивчення молекулярного тіол-дісульфідного механізму визначення специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком і розробки запропонованого способу. Запропонований спосіб при обстеженні здорових (донорів) і хворих здійснюється таким чином. У обстежуваного, з дотримуванням правил асептики, здійснюють забір венозної крові у суху стерильну пробірку та доставляють у лабораторне відділення. Одержують сироватку крові загально прийнятим способом. Після цього в сироватку крові додають необхідний цитостатик (наприклад, вінбластин, вінкристин, циклофосфан та ін.) у співвідношенні 9:1. Здійснюють термостатування такої реакційної суміші при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього визначають вільні небілкові SH-групи у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик методом амперометричного титрування (АМТ) (патент № 20935 А UA, МКБ А61В10/00, G01N27/06, пуб. 07.10.1997). Поява вільних небілкових SH-груп у реакційній суміші свідчить про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком. Відсутність вільних небілкових SHгруп в зазначеній вище реакційній суміші свідчить про те, що специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком не відбулося . Проведене вивчення чутливості та специфічності способу, що пропонується, у здорових осіб (І група - контрольна); у хворих з пухлинними (злоякісними) патологічними процесами - рак, гемобластоз, лімфома та ін. (II гр упа - досвідчена); та у хворих, захворювання яких не було зумовлене пухлинним (злоякісним) патологічним процесом (III група - порівняння). Результати зазначених вище досліджень надані в таблиці. Як видно з таблиці спосіб, що пропонується, дозволяє визначати специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком тільки у хворих з пухлинними (злоякісними) патологічними процесами - рак, гемобластоз, лімфома та ін. (II група досвідчена). Такі дані також є основою для цитостатичної терапії у хворих з пухлинними (злоякісними) патологічними процесами. Крім того, дані таблиці свідчать, що спосіб, який пропонується, дозволяє встановити відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком у здорових осіб (І група - контрольна) та у хворих, захворювання яких не було зумовлене пухлинним (злоякісним) патологічним процесом (III гр упа - порівняння). Отримані результати свідчать про високу чутливість та специфічність запропонованого способу. Приклади конкретного виконання Приклад 1 У донора Г., з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку. Одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. До 450 мкЛ першої порції сироватки крові донора Г. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінбластина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані свідчили про відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінбластином). До 450 мкЛ другої порції сироватки крові донора Г. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінкристина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінкристин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього в реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (вінкристин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані свідчили про відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінкристином). До 450 мкЛ третьої порції сироватки крові донора Г. додавали 50 мкЛ цитостатика (циклофосфана). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані свідчили про відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (циклофосфаном). Приклад 2 У хворої 3., яка знаходиться на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з приводу злоякісного захворювання крові (гемобластоза) - хронічного мієлолейкоза, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку. Одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. До 450 мкЛ першої порції сироватки крові хворої 3. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінбластина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 20,8 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінбластином). До 450 мкЛ другої порції сироватки крові хворої 3. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінкристина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінкристин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+ цитостатик (вінкристин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 24,1 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінкристином). До 450 мкЛ третьої порції сироватки крові хворої 3. додавали 50 мкЛ цитостатика (циклофосфана). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сиро 3 30435 ватка крові+цитостатик (циклофосфан) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 15,2 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (циклофосфаном). Приклад 3 У хворої Б., яка знаходилася на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з приводу раку шийки матки IV ст., з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові в суху стерильну пробірку. Одержували сироватку крові загально- прийнятим способом. До 450 мкЛ першої порції сироватки крові хворої Б. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінбластина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+ цитостатик (вінбластин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 30,0 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінбластином). До 450 мкЛ другої порції сироватки крові хворої Б. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінкристина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінкристин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+ цитостатик (вінкристин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 30,0 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінкристином). До 450 мкЛ третьої порції сироватки крові хворої Б. додавали 50 мкЛ цитостатика (циклофосфана). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 22,5 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (циклофосфаном). Приклад 4 У хворого П., який знаходився на стаціонарному лікуванні у 411 ОВГ з приводу злоякісного лімфопроліферативного процесу - лімфогранулематоз II стадія з поразкою шийних лімфатичних вузлів, з дотримуванням правил асептики здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку. Одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. До 450 мкЛ першої порції сироватки крові хворого П. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінбластина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 33,8 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінбластином). До 450 мкЛ другої порції сироватки крові хворого П. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінкристина). Здійснювали термостатування отриманої реа кційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінкристин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+ цитостатик (вінкристин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 31,2 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінкристином) . До 450 мкЛ третьої порції сироватки крові хворого П. додавали 50 мкЛ цитостатика (циклофосфана). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 17,1 мкМ/л. Такі дані свідчили про специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (циклофосфаном). Приклад 5 У хворого Г., який знаходився на стаціонарному лікуванні в 411 ОВГ з приводу хронічного гепатиту, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові в суху стерильну пробірку. Одержували сироватку крові загальноприйнятим способом. До 450 мкЛ першої порції сироватки крові хворого Г. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінбластина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (вінбластин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані свідчили про відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінбластином). До 450 мкЛ другої порції сироватки крові хворого Г. додавали 50 мкЛ цитостатика (вінкристина). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (вінкристин) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+ цитостатик (вінкристин) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані свідчили про відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (вінкристином). До 450 мкЛ третьої порції сироватки крові хворого Г. додавали 50 мкЛ цитостатика (циклофосфана). Здійснювали термостатування отриманої реакційної суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у реакційній суміші: сироватка крові+цитостатик (циклофосфан) визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л. Такі дані свідчили про відсутність специфічного зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (циклофосфаном). Отримані дані свідчать про те, що спосіб, який пропонується, є чутливий та специфічний, він дозволяє визначати специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком тільки у хворих онкологічного профілю. Спосіб, що пропонується, універсальний, бо він дозволяє визначати специфічне зв'язування 4 30435 білків сироватки крові з різноманітнимицитостатиками (вінбластин, вінкристин, циклофосфан та ін.). За допомогою способу, що пропонується, обгрунтовується необхідність застосування цитостатичної терапії. Таблиця Показники чутливості та специфічності способу, що пропонується Група обстежених Усього обстежено (абс.) І гр упа ІІ гр упа III група 42 25 76 Обстежено способом, що пропонується Знайдене специфічне зв'язування білків сироватки крові з цитостатиком (абс) Вінбластин Вінкристин Циклофосфан 0 О 0 25 25 25 0 0 0 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5