Спосіб інтенсифікації екстрагування гепарину з легенів забійних тварин

Спосіб інтенсифікації екстрагування гепарину з легенів забійних тварин, при якому сировину (ле 3 промышленность» М.: 1970, с.113-116], яке містить найбільшу кількість ознак спільних з заявленим способом (спосіб екстрагування гепарину з легенів забійних тварин, які очищають, промивають, подрібнюють, екстрагують подрібнену сировину (фарш) промисловим розчином екстрагенту (сумішшю 50 г кухонної солі на 1 л води) у співвідношенні 1:2 шляхом перемішування, відстоюють, фільтрують, проводять декілька ступенів екстрагування і осадження гепарину, доводять гепарин до кондиції. Більш докладно це здійснюють наступним чином. Технологічна схема виробництва складається з ряду етапів. 1. Підготовляють виробництво. Заморожену сировину дефростують, звільняють від жиру і великих судин, промивають у проточній воді, в тому числі і від згустків крові. Сорбент КУ-2 перед використанням іонів кальцію обробляють 20-ма об'ємами 2-%-ного розчину їдкого натрію, додаючи його невеликими порціями. Сорбент промивають послідовно дистильованою водою до слаболужної реакції, 5-%-ним розчином сірчаної кислоти до від'ємної реакції на залізо, дистильованою водою до від'ємної реакції на іони сірчаної кислоти. Промитий сорбент переводять в натрієву форму обробка спочатку в 5-%-ному, потім у 2-%-ному розчині кухонної солі до рН (показника концентрації водневих іонів) 4,7-4,8. Отриманий сорбент стерилізують і розливають в скляну тару. 2. Подрібнення сировини і екстракція. Подрібнюють легені на вовчку через решітку з діаметром отворів 2-5мм, і фарш змішують з підсоленою водою, яка містить 50г кухонної солі на 1 літр води у співвідношенні 1:2. При якісному перемішуванні в суміші встановлюють рН8,5-9,5 за допомогою 20-%-ного розчину їдкого натрію і на протязі 1,5год суміш нагрівають до 55-60°С, неперервно перемішуючи; витримують при цій температурі 1год, регулюючи рН розчином їдкого натрію. Потім суміш нагрівають на протязі 1год до кипіння і кип'ятять 5 хвилин. Далі суміш охолоджують до 40-50°С. Густу фракцію відділяють фільтруванням і додатково пресують. Фільтрат і підпресовану рідину з'єднують. 3. Гепарин - сирець осаджують в кислототривкій ємності з мішалкою при температурі 25-30°С, додаючи (1:1) розведену соляну кислоту до рН2,32,6. Утворений осад відстоюють 1-2год, слідкуючи за прозорістю розчину. 4. Обробка гепарину-сирцю солевим розчином і хлористим кальцієм. Відфугований гепаринсирець розчиняють в 4-кратній кількості 15-%-ного розчину кухонної солі, пропускаючи його через вовчок-подрібнювач і протираючи через сітку з отворами 1×1,25мм. Доводять рН до 9-9,5 шляхом додавання 20%ного розчину їдкого натрію, потім при перемішуванні повільно (1,5год) нагрівають до 70°С і додають 1% до об'єму розчину 20%-ний розчин хлористого кальцію. Суміш при повільному періодичному перемішуванні нагрівають і кип'ятять 10хв, потім охолоджують. Рідину збирають в ємності, а осад 45000 4 екстрагують двома об'ємами 10%-ного розчину кухонної солі, підігріваючи до 80-95°С і витримуючи при цій температурі 10 хвилин. Отриманий розчин охолоджують до 40°С, пропускають через дрібну сітку і марлю, відтискають, жмих викидають, а екстракт освітлюють на суперцентрифузі. 5. Перше осадження гепарину спиртом. У освітленому екстракті встановлюють рН8-8,5 і при кімнатній температурі проводять осадження 96° етиловим спиртом у співвідношенні 1:1,5, дають відстоятися рідині на протязі 8-10год після чого прозору рідину з-над осаду сифонують і передають на регенерацію, а каламуть пропускають через сепаратор. 6. Протеоліз. Осад розчиняють в 4-6 об'ємах дистильованої води, пропускаючи через вовчок, і протирають через дрібну сітку. В розчині встановлюють рН8,5-9 20%-ним розчином їдкого натрію, нагрівають до 37-40°С і додають панкреатин медичний з розрахунку 3г активністю 40 одиниць на 1л розчину. Для попередження мікробіального розкладу в розчин додають трикрезол (3 %) і ведуть протеоліз 24-36год при постійних температурі (37-40°С) і рН. Через 6год додають таку ж кількість панкреатину. Потім розчин охолоджують до 15°С і соляною кислотою встановлюють рН2,2-2,5. В осад випадає комплекс гепарин-білок (коричневий). Розчин освітлюють на сепараторі, осад відфуговують на центрифузі і повторно піддають протеолізу. 7. Друге осадження гепарину спиртом. Відсепарований розчин підлужнюють 20%-ним розчином їдкого натрію до рН8-8,5, у випадку помутніння розчин відстоюють 1год, потім пропускають через сепаратор. В освітлений розчин додають 0,1% кухонної солі (1г на 1л) і осаджують гепарин 96°-ним етиловим спиртом, додаючи його в кількості 170%. Осаджений гепарин відстоюють 8-10год при кімнатній температурі. Рідину з-над осаду сифонують і передають на регенерацію, каламуть центрифугують. 8. Осадження баластного білку. Відфугований осад розчиняють в 7 об'ємах дистильованої води, розчин освітлюють на сепараторі. Прозорий розчин підкислюють розведеною соляною кислотою (1:1) до концентрації водневих іонів 2,2-2,5, відстоюють його 30хв і освітлюють на сепараторі. Осад викидають. Освітлений розчин перевіряють на наявність білку пробою з трихлороцтовою кислотою. При наявності білку розчин обробляють 40%-ною трихлороцтовою кислотою, потребу в якій визначають за пробою. Білки осаджують швидко при 0-5°С і тут же центрифугують. Осад викидають, розчин підлужнюють 40%-ним розчином їдкого натрію до рН88,5. При помутнінні розчину його відстоюють 1012год при 8-10°С, потім освітлюють на сепараторі. Осад викидають. 9. Третє осадження гепарину спиртом. В прозорий розчин додають 0,1% хлористого натрію і осаджують 96°-ним етиловим спиртом при кімнатній температурі, додаючи його 100% до об'єму розчину і дають відстоятися 10-12год, потім рідину 5 45000 з-над осаду сифонують і передають на регенерацію, каламуть центрифугують. 10. Обробка розчину гепарину двохвуглекислим натрієм. Осад гепарину розчиняють в 10 об'ємах дистильованої води і додають 40-45г двохвуглекислого натрію на 1л розчину. Розчин нагрівають і кип'ятять 10хв, потім охолоджують до 20°С і освітлюють на сепараторі. Осад вуглекислого кальцію промивають дистильованою водою і викидають. Промивну воду використовують для розчинення осаду наступної порції. 11. Обробка гепарину перекисом водню. В розчин гепарину додають 3-5% пергідролю і, періодично помішуючи, витримують при кімнатній температурі 12-16год, потім нагрівають до 50-60°С, при появі осаду сепарують. 12. Обробка розчину гепарину іонообмінною смолою. Перед цією обробкою встановлюють рН розчину 8-8,5 розбавленою соляною кислотою (1:1), а потім для звільнення розчину від слідів кальцію в нього вносять сорбент КУ-2 в натрієвій формі (з розрахунку 50-100г вологого сорбенту на розчин, отриманий від 100г легенів) при перемішуванні на протязі 20хв, потім розчин фільтрують через стерилізуючі фільтри. 13. Четверте осадження гепарину спиртом. Після фільтрації розчину гепарину розведеною соляною кислотою (1:1), добиваються рН7,6-8,0 і додають хлористий натрій (10г на 1л розчину). Осадження проводять при кімнатній температурі 96°-ним етиловим спиртом. Розчин відстоюється 10-12год. Прозорий розчин з-над осаду сифонують і передають на регенерацію, каламуть центрифугують. Отриманий осад розчиняють в дистильованій воді і фільтрують через стерилізуючий фільтр. 14. П'яте осадження гепарину спиртом. Розчин гепарину охолоджують до 5°С, розведеною соляною кислотою добиваються рН6,5-7,5, додають стерилізований хлористий натрій (3г на 1л розчину) і осаджують охолодженим до 0-5°С 96°-ним етиловим спиртом. Потім розчин відстоюють при 0-5°С на протязі 10-12год. Розчин з-над осаду сифонують і передають на регенерацію, а каламуть центрифугують. Осад двічі промивають охолодженим етиловим спиртом, сушать. Порошок гепарину перевіряють на відповідність технічним умовам і розфасовують. 6 Однак наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, недостатня для отримання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак співпадали з заявленим - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію "новизна". В патентній і науково-технічній літературі не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: в промисловий розчин екстрагенту додатково вводять бутанол в кількості (0,5±0,02) мл на 10мл екстрагенту (суміші). Отже заявлене рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяв зробити висновок про його відповідність критерію "винахідницький рівень". Заявлений результат відноситься до фармацевтичної промисловості, зокрема до технології виготовлення біопрепаратів з сировини забійних тварин, а саме способу виробництва гепарину, сировиною для яких виступають подрібненні легені забійних тварин і може бути використаний для інтенсифікації процесу екстрагування, зменшення затрачуваної потужності при проведенні процесу, зменшення часу на проведення екстрагування і, в результаті, здешевлення процесу виробництва гепарину на підприємствах, які виробляють біопрепарати. А тому відповідає критерію "промислова придатність". Таким чином заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентноспроможності корисної моделі відповідно до статті 7 розділу II Закону України "Про охорону праці на винаходи і корисні моделі" №1771-ІІІ. При інтенсифікації виробництва гепарину відбувається гідромеханічні, механічні і дифузійні процеси. Технологічний процес виробництва гепарину здійснюється аналогічно прототипу.(Описано вище с.1-3 технологічна схема.) В таблиці 1 наведено експериментальні дані визначення коефіцієнта поверхневого натягу при застосуванні в якості поверхнево-активних речовин (ПАР) одноатомних спиртів. Таблиця 1 Зміна коефіцієнта поверхневого натягу екстрагента при застосуванні в якості ПАР деяких одноатомних спиртів № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Кількість доданої ПАР, мл 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 пропанол 0,01145 0,09763 0,00969 0,00858 0,00788 0,00786 0,00787 0,00796 0,00799 Коефіцієнт поверхневого натягу σ, Н/м бутанол бутанол+пропанол 0,00815 0,00900 0,00706 0,01075 0,00739 0,01088 0,00672 0,00646 0,00516 0,00575 0,01021 0,00677 0,00994 0,00892 0,01042 0,00935 0,01028 0,00963 7 45000 Середні товщини приповерхневого ламінарного шару із застосуванням промислового і запропонованого нами розчинів розрахували за методикою [Ю.Л. Білонога, Б.Р. Ціж, Ю.Ю. Варивода, У.Р. Драчук Спосіб інтенсифікації процесу екстрагування хонсуриду із застосуванням поверхневоактивних речовин / Ю.Л. Білонога, Б.Р. Ціж, Ю.Ю. Варивода, У.Р. Драчук // Науковий вісник ЛНУВМ та БТ імені С.З. Гжицького. - 2008. – Т.10. №2. (37). Ar = g × d 3 (ρ c − ρ ч )ρ с µ2 = - С.14-18/] для частинок із середнім діаметром dc≈1 мм. Розглянемо процес екстрагування гепарину промисловим розчином. Середня товщина приповерхневого ламінарного шару при екстрагуванні промисловим розчином: 1.1. Критерій Архімеда: ( 9,8 × 1 × 10 −3 2 де g=9,8м/с - прискорення вільного падіння, ρс - густина середовища (екстрагента), ρч - густина частинки, µ - коефіцієнт динамічної в'язкості, 1.2. Фактор роздільної здатності при виробництві гепарину: Kц = 8 ω2 × D = 0,1836 2×g , (2) ) (1039 − 664 )1039 = 3463 3 0,0105 2 (1) де D - діаметр днища мішалки -1 ω - кутова швидкість обертання мішалки, с 1.3. Модифікований критерій Архімеда: Аrм=Аr×Кц=635,8 (3) 1.4. Коефіцієнт турбулізації приповерхневого шару для турбулентного режиму осадження [Кавецкий Г.Д., Королев А.В., Прцессы и аппараты пищевых производств. М.: Агропромиздат, 1991]: 0,152(ψ × Аrm )0,715 0,152(0,58 × 635,8 )0,715 = = 5,2 (4) 2 2 1.5. Середня товщина приповерхневого ламінарного шару: K ц(п ) = т δ= 9,42 × cos θ × σ g(ρ c − ρ ч ) К ц(ц ) т = 9,42 × 0,88 × 0,01150 9,8(1039 − 664 ) де σ - коефіцієнт поверхневого натягу, ψ=0,58 - коефіцієнт форми частинки, cosθ - гідрофільність частинки. Розглянемо процес екстрагування гепарину при використанні запропонованого розчину. Середнє значення товщини приповерхневого ламінарного шару при використанні в якості екстрагента запропонованого нами розчину: 2.1. Значення критерію Архімеда: Ar = ( 9,8 × 1× 10 −3 ) (1030 − 664 ) × 1030 = 59110 (6). 3 0,00025 2 2.2. Фактор роздільної здатності екстрактора при виробництві гепарину по пункту 1.2: 2.3. Модифікований критерій Архімеда знаходимо по пункту 1.3: Аrm=Аr·Кц=10852 (7) 2.4. Коефіцієнт турбулізації приповерхневого ламінарного шару по пункту 1.4: 0,152(ψ × Аrm ) K ц(п ) = = 39,54 (8) т 2 Комп’ютерна верстка А. Рябко 5,2 = 9,7 × 10 − 3 м , (5) 2.5. Середня товщина приповерхневого ламінарного шару: 9,42 × 0,88 × 0,00516 9,8(1030 − 664 ) δ= = 0,87 × 10 − 3 м , (9) 39,54 Порівнявши товщини приповерхневих ламінарних шарів маємо: δб 9,7 = ≈ 11 разів кращі екстрагуючі власδ з 0,87 тивості. Як видно з таблиці 1, мінімум коефіцієнта поверхневого натягу буде при додаванні до 10мл промислового розчину 0,5мл (±0,02) бутанолу. Це дозволяє інтенсифікувати процес екстрагування, зменшити затрачувану потужність при проведенні екстрагування, зменшити час на проведення екстрагування і, в результаті, здешевлення процесу виробництва гепарину на підприємствах, які виготовляють біопрепарати. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601