Набір для визначення активності ендотеліальної еластази в біологічних рідинах

Набір для визначення активності ендотеліальної еластази в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, препарат протешази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування мийної рідини, інгібітор для пригнічення ак тивності окремих протеїназ, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі препарат протеїнази, фосфатний буфер - 12,5 мл, детергент - 0,75 мл, цитратний буфер - 6 мл, ортофенілендіамш - 2 мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка, який відрізняється тим, що планшет іммобілізований маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Ala-Ala, як препарат протеїнази використовують еластазу у КІЛЬКОСТІ 6 мкл, як інгібітори використовують фенілсульфонілфлюорид у Винахід відноситься до біохімії і може бути використаний в біологи та медицині для наукових досліджень для визначення активності ендотеліальної еластази в біологічних рідинах, а також може бути використаний [3 КЛІНІЧНІЙ практиці Відомий "Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах" (див Пат РФ N 2097762, G 01 N 33/48, А 61 В 19/02), який містить у ВІДПОВІДНИХ упаковках наважку трихлороцтової кислоти, яка при розчиненні у 50 мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, смужки паперу із натрієм азотнокислим, які призначені для утворення діазотуючого розчину безпосередньо перед аналізом (ex tempore), наважку амонію сульфамшокислого, котра при розчиненні у 25 мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин М-(1)нафтилетилендіамінодипдрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0 018 мкмоль стандартного аміну, який аналізують Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність ності нетрипсиноподібних протеїназ (НП хімази, еластазошпбіторної активності а-1-інпбітора протеїназ (а-1-ІП) та рівня а-2- макроглобуліну (а-2МГ) в біологічних рідинах" (див Рішення про видачу патенту України від 18 11 1999 р по з №99063318, G01 N33/48, А61В 19/02) -прототип, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування мийної рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту У наборі для визначення хімази планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Pro-Phe, у наборі для визначення а-2-МГ планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із протамінсульфатом, набір для визначення НП, хімази додатково містить 1 мг інгібітору трипсину із сої (СІТ) для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, набір для визначення а-2МГ додатково містить 3 мг СІТ для пригнічення Недоліком відомого рішення є призначення набору тільки для визначення ароматичних амінів Відомий також "Набір для визначення актив концентрації 0,2 мг/мл КІЛЬКІСТЮ 75 мкл та 6 % розчин етилендіамштетраацетату у КІЛЬКОСТІ 20 мкл 00 (О о ю 45068 залишкової активності трипсину, у наборі для витази, а етилендіамштетраацетат пригнічує значення еластазошпбіторної активності a-1-LU активність металопротеїназ, у тому числі і металопрепаратом протеїнази є еластаза, усі компоненти еластази надані у окремих упаковках при наступному складі Вміст компонентів у наборі забезпечує оптикомпонентів препарат протеїнази (трипсин - 1 мг, мальні умови для здійснення ферментативного еластаза -2-6 мкл), детергент - 0 75 мл, фосфатспособу оцінки активності ендотеліальної еластаний буфер - 12 5 мл, цитратний буфер - 6 мл, орзи тофенілендіамш - 2 мг або 1 таблетка, гідроперит Дослідження по запропонованому наборові 1 таблетка, СІТ -1 або 3 мг, ВІДПОВІДНО були проведені в Інституті терапії АМН України Розрахунки комплектування наборів перевірено Недоліком відомого набору є неспецифічність лабораторними іспитами, щодо визначення ендотеліальної еластази В основу винаходу поставлена задача розробНабір складається із наступних компонентів ки набору, за допомогою якого можна специфічно Полістироловий планшет визначати активність ендотеліальної еластази у з іммобілізованим маркебіологічних рідинах рним ферментом (наприклад, пероксидаза), який Ця задача вирішується тим, що у наборі для комплексно пов'язаний із визначення активності ендотеліальної еластази в субстратом білкової прибіологічних рідинах, який містить полістироловий роди, що містить планшет з іммобілізованим маркерним ферменПОСЛІДОВНІСТЬ А1а-А1а том, що комплексно пов'язаний із субстратом білПрепарат протеїнази кової природи, препарат протеїнази фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеї(еластаза) 6 мкл нази, контрольного матеріалу і дослідних проб для Фосфатний буфер для аналізу, детергент для приготування мийної рідиприготування вихідних ни, інгібітор для пригнічення активності окремих розчинів еластази, інгібіпротеїназ, цитратний буфер, ортофенілендіамш і торів, контрольного матегідроперит для виявлення залишкової активності ріалу і дослідних проб маркерного ферменту, усі компоненти подані в для аналізу 12,5 мл окремій упаковці при наступному складі Детергент для приготування мийної рідини, твін 20 - 0,75 мл препарат протеїнази, фос12,5 мл Інгібітор фенілсульфоніфатний буфер лфлюорид 75 мкл детергент 0,75 мл Інгібітор етилендіамштетцитратний буфер 6 мл раацетат 20 мкл ортофенілендіамш 2 мг - або 1 Цитратний буфер 6 мл таблетка Ортофенілендіамін 2 мг або 1 таблегідроперит 1 таблетка тка згідно винаходу планшет імобілізований маГідроперит для виявленркерним ферментом, що ня залишкової активності комплексно пов'язаний із маркерного ферменту субстратом білкової приропероксидази 1 таблетка ди, ЯКИЙ МІСТИТЬ ПОСЛІДОВАналіз здійснюють за інструкцією, яка надається НІСТЬ А1а-А1а до набору як препарат протеїнази ви6 мкл Приготування реагентів і матеріалів здійснюють таким чином користовують еластазу у КІЛЬКОСТІ 1 Готують рідину для відмивання 0,5 мл детергенту додають до 1 л дистильованої води як інгібітори використовують 0,2 мг/мл фенілсульфонілфлюорид у 2 Готують фосфатний буфер рідину доводять концентрації до 250 мл дистильованою водою і додають 0,25 мкл детергенту КІЛЬКІСТЮ 75 мкл та 6 % розчин етилендіамі20 мкл 3 Відмивають планшет 2-3 рази дистильовантетраацетату у КІЛЬКОСТІ ною водою, яка містить детергент Використання у наборі для визначення актив4 Готують контрольний матеріал шляхом поності ендотеліальної еластази в біологічних рідислідовного розведення вихідного розчину еластази нах планшетів, іммобілізованих маркерним ферза схемою згідно таблиці ментом, що комплексно пов'язаний із субстратом 5 Готують розчин інгібіторів додаванням фебілкової природи, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ А1анілсульфонілфлюориду - 75 мкл та 6 % етилендіА1а, наприклад І\І-сукциніл-А1а-А1а-Уа1, та інгібіамштетраацетату - 20 мкл до 15 мл фосфатного торів, таких як фенілсульфонілфлюорид, етиленбуферу, приготовленого згідно п 2 діамштетраацетат, забезпечує специфічність до7 Готують суміш для виявлення активності слідження саме ендотеліальної (тюлової) маркерного ферменту щггратний буфер розвоеластази Це обумовлено тим що зв'язок А1а-А1а дять у 2 рази дистильованою водою, додають орвважають специфічним до еластаз, фенілсульфотофенілендіамш, гідроперит (готується суміш пенілфлюорид пригнічує активність сері нових протеред використанням) їназ, утому числі і гладко м'язової сері нової елас 45068 значена за калібровочним графіком в Од /мл, Таблиця 2 - розведення зразків під час проведення реакції з інгібіторами Підготовка контрольного матеріалу Приклад 2 Визначення активності ендотеліальної еластази у сироватці крові людини 1 Окремо на титрувальній дошці готують ДОАктивність Буфер, Стандарт, NN Розведення СЛІДНІ зразки (п=40) зразки сироватки крові люди, Од /мл мл мл ни розводять у 250 разів фосфатним буфером, 1 0 0,4 наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 2 0,0005 1 9N4 0,9 0,1 N4 та 10 разів (до 960 мкл буферу додають 40 мкл 3 0,001 1 9N5 0,9 0,1 N5 сироватки, потім до 180 мкл буферу - 20 мкл 1-го 4 0,005 1 9N6 0,9 0,1 N6 розведення сироватки) 5 0,01 1 9N7 0,9 0,1 N7 2 Вносять у лунки титрувальної дошки конт1 9 вихід0,9 0,1 ВИХІДНОрольний матеріал, приготовлений згідно таблиці 6 0,05 ного розчиГО розчину на стор З ну 3 Проводять реакцію пригнічення активності 1 4 вихід0,8 0,2 вихідносершових та метало-протеїназ додаванням до 7 0,1 го розчину ного розчидослідних зразків 1 1 розчину інгібіторів, який прину готовлено як вказано раніше, інкубують 5 хвилин 0,4 вихіднопри 37 °С 8 05 го розчину 4 Вносять контрольний матеріал і ДОСЛІДНІ зразки, які приготовлені згідно гаї 1, 2, у лунки Можливість проведення аналізу з використанвідмитого планшета та інкубують при 37 °С 15 хв ням запропонованого набору наводиться у при(реакція розщеплення іммобілізованого кон'югату кладах маркерного ферменту пероксидази з пептидним Приклад 1 Визначення активності ендотеліасубстратом для еластази) льної еластази у біологічних рідинах у щурів 5 Відмивають плашку як вказано раніше 1 Окремо на титрувальній дошці готують ДО6 Готують 50 % сірчану кислоту (в набір не СЛІДНІ зразки (п=40) сироватки крові та екстрактів входить) тканин щурів 7 Визначають активність маркерного фермен2 Вносять у лунки титрувальної дошки контту додаванням суміші, що приготовлена з цитратрольний матеріал, приготовлений згідно таблиці ного буферу, ортофенілендіамшу та гідропериту на стор З Інкубують до появи диференційного забарвлення 3 Проводять реакцію пригнічення активності 8 Зупиняють реакцію додаванням по 50 мкл у сершових та метало-протеїназ додаванням до лунку 50 % сірчаної кислоти дослідних зразків 1 1 розчину інгібіторів, який при9 Визначають оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчинів при готовлено як вказано раніше, шкубують 5 хвилин 490 нм за допомогою багатоканального мікроспекпри 37 °С трофото метра 4 Вносять контрольний матеріал і ДОСЛІДНІ 10 Будують калібровочний графік за резульзразки, які приготовлені згідно гш 1, 2, у лунки татами вимірювань контрольних зразків та розравідмитого планшета та шкубують при 37°С 15 хв ховують активність ендотеліальної еластази за (реакція розщеплення Іммобілізованого кон югату формулою маркерного ферменту пероксидази з пептидним А = В х 2 (Од /мл), де субстратом для еластази, що містить ПОСЛІДОВА - активність ендотеліальної еластази у НІСТЬ А1а-А1а) Од /мл, 4 Відмивають плашку як вказано раніше В - активність ендотеліальної еластази, що ви5 Готують 50 % сірчану кислоту (у набір не значена за калібровочним графіком в Од /мл, входить) 2 - розведення зразків під час проведення ре6 Визначають активність маркерного ферменакції з інгібіторами, ту додаванням суміші, що містить ортофеніленді250 - розведення зразків сироватки крові люамін та гідроперит у цитратному буфері Інкубують дини, до появи диференційного забарвлення Висновок Вказані приклади підтверджують 7 Зупиняють реакцію додаванням по 50 мкл у можливість здійснення специфічного і високочутлунку 50 % сірчаної кислоти ливого (10"1° Од /мл) способу визначення активно8 Визначають оптичну густину розчинів при сті ендотеліальної еластази у біологічних рідинах у 490 нм за допомогою багатоканального мікроспекщурів і людей, спрощення постановки аналізу за трофото метра рахунок використання наборів 9 Будують калібровочний графік за результаТехнічний результат тами вимірювань контрольних зразків та розрахо1 Можливість специфічного визначення активують активність ендотеліальної еластази за форвності ендотеліальної еластази ферментативним мулою методом А = В х 2 (Од/мл),де — 1П А - активність ендотеліальної еластази у 2 Висока чутливість аналізу 10 Од/мл Од /мл, 3 Спрощення проведення аналізу В - активність ендотеліальної еластази, що ви 45068 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90