Набір для визначення активності або концентрації катепсіну g в біологічних рідинах

Набір для визначення активності або концентрації катепсину G в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Pro-Phe, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування мийної рідини, інгібітор для пригнічення активності Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біологи та медицині для наукових досліджень для визначення активності катепсину G у щурів ферментативним способом або концентрації катепсину G у людей імуноферментним способом, а також може бути використано в КЛІНІЧНІЙ практиці Відомий "Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах" (див Пат РФ № 2097762, G01N 33/48, А61В 19/02), який містить у ВІДПОВІДНИХ упаковках наважку трихлороцтової кислоти, яка при розчиненні у 50мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, смужки паперу із натрієм азотнокислим, які призначені для утворення діазотуючого розчину безпосередньо перед аналізом (ex tempore), наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин N-(1)нафтилетилендіамінодипдрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0 018мкмоль стандартного аміну, який аналізують Використання набору дозволяє спрос трипсиноподібних протеїназ, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі препарат протеїнази, фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамш - 2мг або 1 таблетка, гідроперит -1 таблетка, який відрізняється тим, що як препарат протеїнази використовують катепсин G у КІЛЬКОСТІ 0,008-1 МГ, у наборі для визначення активності катепсину G як інгібітор використовують апротинін у КІЛЬКОСТІ 0,2МГ або 0,2мл, у наборі для визначення концентрації катепсину G планшет іммобілізований антитілами проти катепсину G у концентрації 5мкг/мл, цей набір додатково містить кон'югат антитіл проти катепсину G з маркерним ферментом у КІЛЬКОСТІ 0,1-0,2МГ або 0,025-1 мл тити проведення аналізу і підвищити його точність Недоліком відомого рішення є призначення набору тільки для визначення ароматичних амінів Відомий також "Спосіб визначення активності протеїназ або їх інгібіторів в біологічних рідинах" (див Пат РФ № 1655991, C12Q 1/37), який полягає у використанні полістиролових планшетів з мобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарату протеїнази, детергенту для приготування миючої рідини, фосфатного буферу для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, нитратного буферу, ортофенілендіамшу і гідропериту для виявлення залишкової активності маркерного ферменту Чутливість способу становить — 10 9 — 10 10 г Недоліком відомого способу є складність здійснення етапу підготовки приготування комплексу маркерного ферменту та субстратного білка і його іммобілізація на поверхні полістиролових планшетів, що потребує використання спеціальних реагентів, обладнання, високої кваліфікації оператора Крім того, відомий спосіб не передбачає визна (О (О о чення аісгивності катепсину G Відомий також "Набір для визначення активності нетрипсиноподібних протеїназ (НП), хімази, еластазошпбіторної активності а-1-інпбітора протеїназ (а-1-ІП) та рівня а-2-макроглобуліну (а-2МГ) в біологічних рідинах" [див Рішення про видачу патенту України від 18 11 1999 поз №99063318, G01N 33/48, А61В 19/02] - прототип, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту У наборі для визначення хімази планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Pro-Phe, у наборі для визначення а-2-МГ планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із протамінсульфатом, набір для визначення НП, хімази додатково містить 1мг інгібітору трипсину із сої (СІТ) для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, набір для визначення а-2-МГ додатково містить Змг СІТ для пригнічення залишкової активності трипсину, у наборі для визначення еластазошпбіторної активності а-1-ІП препаратом протеїнази є еластаза, усі компоненти надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів препарат протеїнази (трипсин - 1мг, еластаза - 2 44066 КІЛЬКОСТІ 0,2мг або 0,2мл, - у наборі для визначення концентрації катепсину G планшет іммобілізований антитілами проти катепсину G у концентрації 5мкг/мл, - набір для визначення концентрації катепсину G додатково містить кон'югат антитіл проти катепсину G з маркерним ферментом у КІЛЬКОСТІ 0,1 0,2мг або 0,025-1мл Використання у наборі для визначення катепсину G апротиншу сприяє підвищенню специфічності, яку у свою чергу забезпечує субстрат, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Pro-Phe Це обумовлено тим, що звязок Pro-Phe вважають високочутливим до катепсину G, а апротинш пригнічує активність трипсиноподібних ферментів, які можуть розщеплювати глобулярні білки, такі як маркерний фермент Іммобілізація планшету антитілами проти катепсину G у наборі для визначення концентрації катепсину G та додатковий вміст кон'югату антитіл проти катепсину G з маркерним ферментом забезпечує специфічність визначення катепсину G імуноферментним методом Необхідність використання імуноферментного методу обумовлено тим, що хімаза людини, на відміну від хімази щурів, має однакову субстратну специфічність з катепсином G, а інгібітори, які пригнічують хімазу людини, але не впливають на активність катепсину G, не ВІДОМІ ВМІСТ компонентів у запропонованому наборі забезпечує оптимальні умови для здійснення ферментативного та імуноферментного способів оцінки активності та концентрації катепсину G у щурів - бмкл), детергент - 0 75мл, фосфатний буфер 12,5мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамш - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка, СІТ - 1 або Змг, ВІДПОВІДНО Недоліком відомого набору є неспецифічність щодо визначення катепсину G В основу винаходу поставлена задача розробки набору, за допомогою якого можна специфічно визначати катепсин G у біологічних рідинах людей, щурівта інших тварин Ця задача вирішується тим, що у наборі для визначення активності або концентрації катепсину G в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ ProPhe, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, інгібітор для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі препарат протеїнази, фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамш - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка, згідно винаходу - у якості препарату протеїнази використовують катепсин G у КІЛЬКОСТІ 0,008 - 1 мг - у наборі для визначення активності катепсину G у якості інгібітору використовують апротинш у та людини, ВІДПОВІДНО Дослідження по запропонованому наборові були проведені в Інституті терапії АМН України Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами Набір складається із наступних компонентів - Полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом (наприклад, пероксидаза), який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ Pro-Phe, або антитілами проти катепсину G - Препарат протеїнази (катепсин G) - 0,008 1мг - Фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу - 12,5мл - Детергент для приготування миючої рідини, твш-20 - 0,75мл - Апротинш - 0,2мг або 0,2мл, присутній у наборі для визначення активності катепсину G у якості інгібітору - Кон'югат антитіл проти катепсину G з маркерним ферментом - 0,1 - 0,2мг або 0,025 - 1мл, присутній у наборі для визначення вмісту катепсину G - Цитратний буфер - бмл - Ортофенілендіамш - 2мг або 1 таблетка - Гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту пероксидази - 1 таблетка Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору Приготування реагентів і матеріалів здійснюють таки чином 44066 1 Готують рідину для відмивання 0,5мл дете5 Готують розчин апротиншу (ферментативргенту додають до 1л дистильованої води ний аналіз) додаванням 9,8мл фосфатного буфе2 Готують фосфатний буфер рідину доводять РУ до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мкп 6 Готують розчин кон'югату (імуноферментний детергенту аналіз) додаванням 25мл фосфатного буферу 3 Відмивають планшет 2 - 3 рази дистильо7 Готують суміш для виявлення активності ваною водою, яка містить детергент маркерного ферменту цитратний буфер розво4 Готують контрольний матеріал шляхом подять у 2 рази дистильованою водою, додають орслідовного розведення вихідного розчину за схетофенілендіамш, гідроперит (готується суміш пемами згідно Табл 1 або 2 ред використанням) Таблиця 1 Підготовка контрольного матеріалу для визначення активності катепсину G (ферментативний метод) № Концентрація, мкг/мл Розведення Буфер, мл Стандарт, мл 1 0 2 3 0,4 0,005 1 9 стандарту № 3 0,36 0,04 стандарту № 3 0,05 1 9 стандарту № 4 0,36 0,04 стандарту № 4 4 0,5 1 9 стандарту № 5 0,36 0,04 стандарту № 5 5 5 1 9 стандарту № 6 0,36 0,04 стандарту № 6 6 50 1 9 стандарту № 7 0,36 0,04 стандарту № 7 7 500 1 9 стандарту № 8 0,36 0,04 стандарту № 8 8 5000 1 9 стандарту 0,49 0,045 мл стандарту Можливість проведення аналізу з використанням запропонованого набору наводиться у прикладах Приклад 1 Визначення активності катепсину G v біологічних рідинах у щурів 1 Окремо на титрувальній дошці готують ДОСЛІДНІ зразки (п = 40) сироватки крові та екстрактів тканин щурів 2 Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал, приготовлений згідно Табл 1 3 Проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ (трипсин, калікреш) додаванням до дослідних зразків 1 1 розчину апротиншу, шкубують 5 хвилин при 37°С 3 Вносять контрольний матеріал і ДОСЛІДНІ зразки, які приготовлені згідно пп 1, 2, у лунки відмитого планшета та шкубують при 37°С 15хв (реакція розщеплення іммобілізованого кон'югату маркерного ферменту пероксидази з пептидним субстратом для катепсину G) 4 Відмивають плашку як вказано раніше 5 Готують 50 % сірчану кислоту (у набір не входить) 6 Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що містить ортофенілендіамш та гідроперит у цитратному буфері Інкубують до появи диференційного забарвлення 7 Зупиняють реакцію додаванням по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти 8 Визначають оптичну густину розчинів при 490нм за допомогою багатоканального мікро спектрофотометра 9 Будують калібровочний графік за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність катепсину G за формулою . В 4 2 1000. . А= (г/л год.) 1000000 А - активність катепсину G у г/л год , В - концентрація катепсину G, що визначена за калібровочним графіком в мкг/мл, 4 - коефіцієнт перерахунку на 1 годину, 2 - розведення зразків під час проведення реакції пригнічення активності трипсиноподібних ферментів, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, 1000000 - коефіцієнт перерахунку у грами Приклад 2 Визначення концентрації катепсину G v сироватці крові людини 1 Окремо на титрувальній дошці готують ДОСЛІДНІ зразки (п = 40) зразки плазми/сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки) Зразки слини людини розведення не потребують 2 Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал, приготовлений згідно Табл 2, с 6 3 Вносять контрольний матеріал і ДОСЛІДНІ зразки, які приготовлені згідно пп 1, 2, у лунки відмитого планшета та інкубують при 37°С 1год (реакція звязування антитіл з антигеном) 4 Відмивають планшет як вказано раніше 5 Проводять реакцію зв'язування антигену (катепсину G) з кон югатом антитіла-пероксидаза протягом 1год при 37°С Кон'югат, який не зв'язався з антигеном відмивають як вказано раніше 6 Готують 50% сірчану кислоту (в набір не входить) 7 Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що приготовлена з цитратного буферу, ортофенілендіамшу та гідропериту Інкубують до появи диференційного забарвлення 8 Зупиняють реакцію додаванням по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти 9 Визначають оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчинів при 490нм за допомогою багатоканального мікро спектрофотометра 44066 10 Будують калібровочний графік по результатам вимірювань контрольних зразків та розраховують концентрацію катепсину G за формулою _ В 250 1000. . . С= (г/л) 1000000000 8 за калібровочним графіком в мкг/мл, С - концентрація катепсину G в г/л, 250 - розведення зразків сироватки крові людини, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, 1000000000 - коефіцієнт перерахунку у грами В - концентрація катепсину G, що визначена Таблиця 2 Підготовка контрольного матеріалу для визначення концентрації катепсинуС (імуноферментнии метод) Стандарт, мл № Концентрація, нг/мл Розведення Буфер, мл 1 0 10 2 12,5 1 62,5 0,5 0,5 стандарту № 3 3 25,0 1 125 0,5 0,5 стандарту № 4 4 50,0 1 250 0,5 0,5 стандарту № 5 5 100,0 1 500 0,5 0,5 стандарту № 6 6 200,0 1 1000 0,5 0,5 стандарту № 7 7 400,0 1 2000 0,5 0,5 стандарту № 8 8 8000,0 1 4000 0,5 0,016 мкл стандарту Висновок Вказані приклади підтверджують можливість здійснення специфічних і високочутливих (10 9 - 10 10 г) способів визначення активності або концентрації катепсину G у щурів і людей, спрощення постановки аналізу за рахунок використання наборів Технічний результат 1 Можливість специфічного визначення активності або концентрації катепсину G для його дослідження у щурів ферментативним методом і у людей - імуноферментним методом 2 Висока чутливість аналізу 10 9 — 10 10 г 3 Спрощення проведення аналізу ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90