Набір для визначення активності кальпаїнів в біологічних рідинах

Набір для визначення активності кальпашів в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із білковим субстратом альбуміну сироватки бика, препарат протеїнази - трипсин, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, кон трольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, інгібітор для пригнічення активності окремих протеїназ, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі трипсин 1 мг, фосфатний буфер - 12,5 мл, детергент - 0,75 мл, цитратний буфер - 6 мл, ортофенілендіамш - 2 мг або 1 таблетка, гідроперит -1 таблетка, який відрізняється тим, що набір додатково містить хлорид кальцію у КІЛЬКОСТІ не більше 18,3 мг, цистеїн у КІЛЬКОСТІ не більше 25,98 мг, а як інгібітор для пригнічення активності окремих протеїназ ви Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біологи та медицині для наукових досліджень для визначення активності кальційзалежних протеїназ в біологічних рідинах, а також ності нетрипсиноподібних протеїназ (НП), хімази, еластазошпбіторної активності а-1-інпбітора протеїназ (а-1-ІП) та рівня а-2-макроглобуліну (а-2МГ) в біологічних рідинах" (див деклараційний патент України № 34208 А, МПК G01 N33/48, А61В19/02) - прототип, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту У наборі для визначення хімази планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ РгоPhe У наборі для визначення а-2-МГ планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із протамшсульфатом Набір для визначення НП, хімази містить Імг інгібітору трипсину із сої (СІТ) для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ Набір для визначення а-2-МГ містить Змг СІТ для пригнічення залишкової активності трипсину У наборі для визначення еластазошпбіторної активності а-1-ІП препаратом протеїнази є еластаза Усі компоненти - в КЛІНІЧНІЙ практиці Відомий "Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах" (див Пат РФ N 2097762, G 01 N 33/48, А 61 В 19/02), який містить у ВІДПОВІДНИХ упаковках - наважку трихлороцтової кислоти При розчиненні у 50мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, - смужки паперу із натрієм азотнокислим, які призначені для утворення діазотуючого розчину безпосередньо перед аналізом (extempore), - наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин N-(1)нафтилетилендіамінодипдрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0,018мкмоль стандартного аміну, який аналізують Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність Недоліком відомого рішення є призначення набору тільки для визначення ароматичних амінів Відомий також "Набір для визначення актив користовують етилендіамінтетраацетат у КІЛЬКОСТІ 96,3 мг і менше 1 ю CO (О 46357 надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів препарат протеїнази (трипсин - 1мг, еластаза - 2 - бмкл), детергент - 0,75мл, фосфатний буфер - 12,5мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамш - 2мг або 1 таблетка, гідроперит 1 таблетка, СІТ -1 або Змг, ВІДПОВІДНО Недоліком відомого набору є неспецифічність щодо визначення кальпашів В основу винаходу поставлена задача розробки набору, за допомогою якого можна специфічно визначати активність кальпашів у біологічних рідинах Ця задача вирішується тим, що у наборі для визначення активності кальпашів в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, а саме альбуміном сироватки бика (БСА), препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, інгібітор для пригнічення активності окремих протешаз, цитратний буфер, ортофенілендіамш і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі препарат протеїнази трипсин - 1мг, фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамш (ОФД) - 2мг або 1 таблетка, гідроперит 1 таблетка Згідно винаходу набір додатково містить хлорид кальцію (СаСІ_2) у КІЛЬКОСТІ не більш 18,Змг, цистеїн у КІЛЬКОСТІ не більш 25,98мг, а у якості інгібітору для пригнічення активності окремих протеїназ використовують етилендіамштетраацетат (ЕДТА) у КІЛЬКОСТІ 96,Змг і менш Додаткова наявність у наборі СаСІ_2 і цистеїну сприяє активації Са2+-залежних нейтральних протешаз, а використання в якості інгібітору ЕДТА забезпечує пригнічення металопротешаз Це обумовлено тим, що активність кальпашів визначають як різницю протеолітичної активності зразків біологічної рідини з добавленням СаСІ_2 і цистеїну до кінцевих концентрацій 5 т М і дублікатів зразків з добавленням ЕДТА до кінцевої концентрації ЮтМ ВМІСТ І певна КІЛЬКІСТЬ компонентів у наборі забезпечує оптимальні умови для здійснення високочутливого ферментативного способу оцінки активності кальпашів одночасно 18 проб у дублікаті Дослідження по запропонованому наборові були проведені в Інституті терапії АМН України Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами Набір складається із наступних компонентів - Полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом (наприклад, пероксидаза), який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи (альбумін сироватки бика) крім лунки АІ для контролю насичення забарвлення - Препарат протеїнази (трипсин) - 1мг - Фосфатний буфер для приготування вихідних розчинів трипсину, ЕДТА, СаСІ_2 і цистеїну, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу 12,5мл - Детергент для приготування миючої рідини, твш-20 - 0,75мл - Інгібітор ЕДТА - 96,Змг і менш - СаСІ_2 - не більш 18,Змг - Цистеїн - не більш 25,98мг - Цитратний буфер - бмл - ОФД - 2мг або 1 таблетка - Гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту пероксидази -1 таблетка Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору Приготування реагентів і матеріалів здійснюють таким чином 1 Готують рідину для відмивання 0,5мл детергенту додають до 1л дистильованої води 2 Готують фосфатний буфер рідину доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мкл детергенту 3 Відмивають планшет 2 - 3 рази дистильованою водою, яка містить детергент 4 Готують вихідний розчин трипсину додаванням 2мл 0,0025 N НСІ, потім 160мкл отриманого розчину додають до 25мл фосфатного буферу, що приготовлено згідно п 2 5 Готують контрольний матеріал шляхом послідовного розведення за схемою згідно таблиці Таблиця Підготовка контрольного матеріалу № 1 2 3 4 5 6 7 8 Активність, МКГ/МЛ 0 Розведення Буфер, мл 0,005 0,01 0,05 19N4 1 9N5 1 3N6 1 9N7 1 19N8 1 7 вихідного розчину 1 1 вихідного розчину 0,9 0,9 0,9 0,6 0,9 0,1 0,2 1 4 6 Згідно винаходу готують розчин, який містить СаСІ_2 і цистеїн, додаванням фосфатного буферу, що приготовлено згідно п 2 Для цього 0,95 0,7 0,5 Стандарт, мл 0,1 N 4 0,1 N 5 0,2 N 6 0,1 N 7 0,05 N 8 0,1 вихідного розчину 0,5 вихідного розчину додають у флакони з СаСІ_2 і цистеїном по 1,5мл буферу та змішують їх 7 Згідно винаходу готують розчин ЕДТА дода 46357 ванням Змл фосфатного буферу, який приготов4 - коефіцієнт перерахунку на 1 год , лено згідно п 2 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, 1000 - коефіцієнт перерахунку в мг 8 Готують суміш для виявлення активності Приклад 2 Визначення активності кальпашів у маркерного ферменту цитратний буфер розвосироватці крові людини дять у 2 рази дистильованою водою, додають ОФД, гідроперит (готується суміш перед викорис1 Окремо на титрувальній дошці готують ДОтанням) СЛІДНІ зразки (п = 40) зразки сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, Можливість проведення аналізу з використаннаприклад, шляхом послідовного розведення у 25 ням запропонованого набору наводиться у прита 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сикладах роватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розПриклад 1 Визначення активності кальпашів у ведення сироватки) біологічних рідинах у щурів 1 Окремо на титрувальній дошці готують ДО2 Вносять у лунки титрувальної дошки контСЛІДНІ зразки (п = 18 - 38) сироватки крові та екстрольний матеріал, приготовлений згідно таблиці рактів тканин щурів на стор З 2 Вносять у лунки титрувальної дошки конт3 Перед проведенням протеолітичної реакції рольний матеріал, приготовлений згідно вищенарозщеплення іммобілізованого комплексу добавведеної таблиці ляють в лунки відмитого планшета (ряди 3 - 12) по Юмкл СаСІ_2+цистеш (наприклад, ряди 3, 5, 7, 11) 3 Перед проведенням протеолітичної реакції і паралельно ЕДТА (наприклад, ряди 4, 6, 8, 12) розщеплення іммобілізованого комплексу добавляють в лунки відмитого планшета (ряди 3 - 12) по 4 Вносять контрольний матеріал (ряди 1-й і 2Юмкл СаСІ_2+цистеш (наприклад, ряди 3, 5, 7, 11) й) і ДОСЛІДНІ зразки (крім лунок A3, А4, ВЗ, В4), які і паралельно ЕДТА (наприклад, ряди 4, 6, 8, 12) приготовлені згідно пп 1, 2, у лунки планшета, який містить СаСІ_2+цистеш або ЕДТА, інкубують 4 Вносять контрольний матеріал (ряди 1-й і 2при 37°С 15хв (реакція розщеплення іммобілізовай) і ДОСЛІДНІ зразки (крім лунок A3, А4, ВЗ, В4), які ного кон'югату маркерного ферменту пероксидази приготовлені згідно пп 1, 2, у лунки планшета, зБСА) який містить СаСІ_2+цистеш або ЕДТА, шкубують при 37°С 15хв (реакція розщеплення іммобілізоваЛунки A3, ВЗ, А4, В4 планшету використовуного кон'югату маркерного ферменту пероксидази ють як додатковий контроль для оцінки впливу зБСА) СаСІ_2+цистеш або ЕДТА на активність іммобілізованого маркерного ферменту, в ці лунки додають Лунки A3, ВЗ, А4, В4 планшету використовупо Юмкл СаСІ_2+цистеш або ЕДТА та робочий ють як додатковий контроль для оцінки впливу буфер замість дослідних проб СаСІ_2+цистеш або ЕДТА на активність іммобілізованого маркерного ферменту, в ці лунки додають 5 Відмивають плашку як вказано раніше по Юмкл СаСІ_2+цистеш або ЕДТА та робочий 6 Готують 50% сірчану кислоту (в набір не буфер замість дослідних проб входить) 4 Відмивають плашку як вказано раніше 7 Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що приготовлена з цитрат5 Готують 50% сірчану кислоту (у набір не ного буферу, ОФД та гідропериту Інкубують до входить) появи диференційного забарвлення 6 Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що містить ОФД та гідропе8 Зупиняють реакцію додаванням по 50мкл у рит у цитратному буфері Інкубують до появи дилунку 50% сірчаної кислоти ференційного забарвлення 9 Визначають оптичну ЩІЛЬНІСТЬ розчинів при 7 Зупиняють реакцію додаванням по 50мкл у 490нм за допомогою багатоканального мікроспеклунку 50% сірчаної кислоти трофото метра 8 Визначають оптичну густину розчинів при 10 Будують калібровочний графік за резуль490нм за допомогою багатоканального мікроспектатами вимірювань контрольних зразків та розратрофото метра ховують активність кальпашів за формулою 9 Будують калібровочний графік за результа(Ан-АоіЮОО 4 250 ... .. , тами вимірювань контрольних зразків розрахову-^-! ^ (а/еаіа ), ють активність кальпашів у дослідних пробах за 1000000 формулою Аі - протеолітична активність зразку з добавленням СаСІ_2+цистеша, яка визначена за каліб4 __. _. . (іа/е аіа), ровочним графіком залежності оптичної густини (з 1000 урахуванням впливу на активність іммобілізованоАі - протеолітична активність зразку з добавго маркерного ферменту) від концентрації трипсиленням СаСІ_2+цистеша, яка визначена за калібну у контрольних зразках, мкг/мл, ровочним графіком залежності оптичної густини (з Аг - протеолітична активність зразку з добавурахуванням впливу на активність іммобілізованоленням ЕДТА, яка визначена за калібровочним го маркерного ферменту) від концентрації трипсиграфіком залежності оптичної густини (з урахуванну у контрольних зразках, мкг/мл, ням впливу на активність іммобілізованого маркеАг - протеолітична активність зразку з добаврного ферменту) від концентрації трипсину у контленням ЕДТА, яка визначена за калібровочним рольних зразках, мкг/мл, графіком залежності оптичної густини (з урахуван4 - коефіцієнт перерахунку на 1 год , ням впливу на активність іммобілізованого марке1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, рного ферменту) від концентрації трипсину у конт1000000 - коефіцієнт перерахунку в г рольних зразках, мкг/мл, 250 - розведення зразків сироватки крові лю 7 46357 8 дини використання наборів Висновок Вказані приклади підтверджують Технічний результат можливість здійснення специфічного і високочут1 Можливість специфічного визначення акти10 ливого (10 Од /мл) способу визначення активноевності кальпашів мікрометодом 9 10 ті кальпашів у біологічних рідинах (у щурів і лю2 Висока чутливість аналізу 10 -10 Од/мл дей), спрощення постановки аналізу за рахунок 3 Спрощення проведення аналізу ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71