Набір для визначення активності металоеластази в біологічних рідинах

Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біології та медицині для наукових досліджень , а також в клінічній практиці для визначення активності металоеластази в біологічних рідинах у експериментальних тварин та людей. Відомий "Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах" (див. Пат. РФ N 2097762, G01N33/48, A61В19/02), який містить у відповідних упаковках наважку трихлороцтової кислоти, яка при розчиненні у 50мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, смужки паперу із натрієм азотнокислим, які призначені для утворення діазотуючого розчину безпосередньо перед аналізом (ex tempore), наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25 мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин N-(1)нафтилетилендіамінодигідрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0,018мкмоль стандартного аміну, який аналізують. Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність. Відомий також "Набір для визначення активності ендотеліальної еластази в біологічних рідинах" (див. Деклар. Патент України №45068 А; МПК G01N33/48, А61В19/02; Заявка №2001042735; дата подачі заявки: 23.04.01p.; Опубл.: 15.03.02р. Бюл.№3) - прототип, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, препарат протеїнази, фосфа тний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, інгібітор для пригнічення активності окремих протеїназ, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту. Усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі: препарат протеїнази, фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - 6мл, ортофенілендіамін - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка. Планшет іммобілізований маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, який містить послідовність Ala-Ala. У якості препарату протеїнази використовують еластазу у кількості 6мкл. У якості інгібіторів використовують фенілсульфонілфлюорид у концентрації 0,2мг/мл кількістю 75мкл та 6% розчин етилендіамінтетраацетату у кількості 20мкл. Загальним недоліком вищенаведених відомих наборів є неспецифічність щодо визначення активності металоеластази в біологічних рідинах. В основу винаходу поставлена задача розробки такого набору, у якому підбір концентрації інгібітору ендотеліальної (тіолової) еластази забезпечить можливість специфічно визначати активність металоеластази у біологічних рідинах високочутливим мікрометодом. Ця задача вирішується у наборі для визначення активності металоеластази в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, який містить послідовність Ala-Ala, еластазу, інгібітор серінових протеїназ фенілсульфонілфлюорид, фосфатний буфер, де тергент, цитратний буфер, ортофенілендіамін, усі компоненти надані в окремій упаковці при певному складі. Згідно винаходу набір додатково містить інгібітор ендотеліальної (тіолової) еластази, а саме монойодацетат у кількості 1 або 2мг, робоча концентрація монойодацетату становить 0,01мкг/мл. Додаткова наявність у наборі для визначення активності металоеластази в біологічних рідинах інгібітору ендотеліальної (тіолової) еластази - монойодацетату забезпечує специфічність дослідження саме металоеластази. Це обумовлено тим, що усі еластази, і ендотеліальна (тіолова), і нейтрофільна (серінова), і макрофагальна (металоеластаза) розщеплюють один і той же зв'язок, а саме Ala-Ala, і для їх ди ференційного визначення необхідно пригнічувати активність конкуруючи х еластаз. Вміст монойодацетату у наборі та певна його робоча концентрація забезпечує оптимальні умови для здійснення ферментативного способу оцінки активності металоеластази в біологічних рідинах з високою чутливістю. Дослідження по запропонованому наборові були проведені в Інституті терапії АМН України. Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами. Набір складається із наступних компонентів: - Полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом (наприклад, пероксидаза), який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи, що містить послідовність Ala-Ala. - Еластаза - 6мкл. - Фосфатний буфер для приготування вихідних розчинів еластази, інгібіторів, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу - 12,5мл. - Детергент для приготування миючої рідини та буферного розчину, твін-20-0,75мл. - Цитратний буфер - 6мл. - Ортофенілендіамін - 2мг або 1 таблетка. - Гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту пероксидази - 1 таблетка. - Інгібітор серінових протеїназ - фенілсульфонілфлюорид - 75мкл. Згідно винаходу набір додатково містить інгібітор ендотеліальної (тіолової) еластази - монойодацетат - 1 або 2мг. Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору. Приготування реагентів і матеріалів здійснюють таким чином: 1. Готують рідину для відмивання: 0,5мл детергенту додають до 1л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину доводять до 500 мл дистильованою водою і додають 0,5мл детергенту. 3. Відмивають планшет 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують контрольний матеріал шляхом послідовного розведення вихідного розчину еластази за схемою згідно таблиці. 5. Готують вихідний розчин монойодацетату додаванням 200 або 400мл робочого буфер у, відповідно. 6. Готують інгібіторний розчин додаванням фенілсульфонілфлюориду та 30мкл монойодацетату, приготовленого за п. 5 до 15 мл фосфатного буферу, приготовленого згідно п.2. 7. Готують суміш для виявлення активності маркерного ферменту: цитратний буфер розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін, гідроперит (готується суміш перед використанням). Таблиця Підготовка контрольного матеріалу NN 1 2 3 4 5 6 7 8 Активність, Од./мл 0 0,0005 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 Розведення 1:9 N 4 1:9 N 5 1:9 N 6 1:9 N 7 1:9 вихідного розчину 1:4 вихідного розчину Буфер, мл 0,4 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 Стандарт, мл 0,1 N 4 0,1 N 5 0,1 N 6 0,1 N 7 0,1 вихідного розчину 0,2 вихідного розчину 0,4 вихідного розчину Можливість проведення аналізу з використанням запропонованого набору наводиться у прикладах. Приклад 1. Визначення активності металоеластази у біологічних рідинах у щурів. 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (n=40) сироватки крові та екстрактів тканин щурів по 200мкл, приготовлені наперед, наприклад, шляхом гомогенізації 300мг тканини в 3мл фізіологічного розчину, центрифугування при 5000об./хв. на центрифузі тип у PC-6 протягом 30 хвилин при 4-6°С. 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал, приготовлений згідно таблиці. 3. Проводять реакцію пригнічення активності серінової (нейтрофільної) та тіолової (ендотеліальної) еластаз додаванням до дослідних зразків по 200мкл (1:1 за об'ємом) інгібіторного розчину з фенілсульфонілфлюориду та монойодацетату, який приготовлено як вказано раніше, інкубують до 5 хвилин при 37°С. 4. Переносять контрольний матеріал і дослідні зразки, які приготовлені згідно пп.2, 3, у лунки відмитого планшета та інкубують при 37°С 15хв. (реакція розщеплення іммобілізованого кон'югату маркерного ферменту пероксидази з пептидним субстратом для еластази, що містить послідовність Ala-Ala). 4. Відмивають плашку як вказано раніше. 5. Готують 50% сірчану кислоту (у набір не входить). 6. Визначають залишкову активність маркерного ферменту додаванням суміші, що містить ортофенілендіамін та гідроперит у нитратному буфері. Інкубують до появи диференційного забарвлення. 7. Зупиняють реакцію додаванням по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти. 8. Визначають оптичну густину розчинів при 490нм за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра. 9. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність металоеластази за формулою: А=В*2*10 (Од./г тканини), де: А - активність металоеластази у Од./г тканини, В - активність металоеластази, що визначена за каліброваною кривою в Од./мл, 2 - розведення зразків під час проведення реакції з інгібіторами, 10 - коефіцієнт перерахунку на г тканини. Приклад 2. Визначення активності металоеластази у сироватці крові людини. 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (n=40): зразки сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки). 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал, приготовлений згідно таблиці на стор.3. 3. Проводять реакцію пригнічення активності серінової (нейтрофільної) та тіолової (ендотеліальної) еластаз додаванням до дослідних зразків по 200 мкл інгібіторного розчину з фенілсульфонілфлюориду та монойодацетату, які приготовлено як вказано раніше, інкубують до 5 хвилин при 37°С. 4. Переносять контрольний матеріал і дослідні зразки з титрувальної дошки у лунки відмитого планшета за допомогою багатоканального мікродозатора та інкубують при 37°С 15хв. (реакція розщеплення іммобілізованого кон'югату маркерного ферменту пероксидази з пептидним субстратом для еластази). 5. Відмивають плашку як вказано раніше. 6. Готують 50% сірчану кислоту (в набір не входить). 7. Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що приготовлена з нитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують до появи диференційного забарвлення. 8. Зупиняють реакцію додаванням по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти. 9. Визначають оптичну щільність розчинів при 490нм за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра. 10. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність ендотеліальної еластази за формулою: А=В*2*250(Од./мл), де: А - активність металоеластази у Од./мл, В - активність металоеластази, що визначена за каліброваною кривою в Од./мл, 2 - розведення зразків під час проведення реакції з інгібіторами, 250 - розведення зразків сироватки крові людини. Висновок: Вказані приклади підтверджують можливість здійснення специфічного і високочутливого (10-10 Од./мл) способу визначення активності металоеластази у біологічних рідинах у щурів і людей, спрощення постановки аналізу за рахунок використання наборів. Технічний результат. Використання винаходу у порівнянні з прототипом забезпечує можливість специфічного визначення активності металоеластази. Чутливість аналізу - 10-10 Од. на 1мл біологічної рідини або 1г тканини. Відтворюваність способу за набором становить близько 95%.