Спосіб визначення вмісту еуфіліну у водному розчині

1 Спосіб визначення вмісту еуфіліну у водному розчині, що містить фільтрацію та центрифугування проби, який відрізняється тим, що заздалегідь приготовляють перший, другий і третій буферні розчини, після фільтрації пробу змішують з третім буферним розчином, як активатором еуфіліну, та центрифугують зі швидкістю 20006000 об/хв протягом 2-6 хв, надалі між пробою та другим буферним розчином,як електролітичним середовищем, встановлюють капілярну трубку, з можливістю підтримки внутрішнього тиску на рівні ЗО бар протягом 15 сек, підводять до них потенціали високовольтного джерела напругою 20 кВ, комутують ланцюги живлення, реєструють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби під час її переміщення крізь капілярну трубку, ідентифікують та визначають Винахід відноситься до досліджень або аналізу матеріалів, здебільшого шляхом розділення їх на складові частини, та може бути використаним в дослідженнях фармаційних та ХІМІЧНИХ лабораторій Еуфілін (Euphilhnum) являє серцево-судинний, переважно спазмолітичним засобом складу якого входять 80% теофіліну та 20% етилендіаміду (синоніми Ammocardol, Aminophilhnum, Ammophilhn, Diaphilhn (В), Gemophilhn, Metaphilhn, Neophillm тощо) [1] ВІДОМІ способи визначення вмісту еуфіліну у водних розчинах, в яких здійснюють кислотну об вміст еуфіліну шляхом перетворення даних в аналоговий сигнал 2 Спосіб визначення вмісту еуфіліну у водному розчині за п 1, який відрізняється тим, що перший буферний розчин містить борну кислоту, тетраборат натрію та воду дистильовану при наступному співвідношенні інгредієнтів, см 3 борна кислота при концентрації 0,2 моль/дм3 5,5 тетраборат натрію при концентрації 0,05 моль/дм3 6,5 вода дистильована 38,0 3 Спосіб визначення вмісту еуфіліну у водному розчині за п 1, який відрізняється тим, що другий буферний розчин містить поряд з першим буферним розчином д од еци л сульфат натрію та воду дистильовану при наступному співвідношенні інгредієнтів, см перший буферний розчин 25,0 додецилсульфат натрію при концентрації 0,2 моль/дм3 10,0 вода дистильована 15,0 4 Спосіб визначення вмісту еуфіліну у водному розчині за п 1, який відрізняється тим, що третій буферний розчин містить другий буферний розчин і воду дистильовану у співвідношенні 110 робку проби, и екстрагування хлороформовою сумішшю, фільтрацію, випаровування, центрифугування, розчинення сухого залишку розчином соляної кислоти та хроматографування, з використанням як елюенту суміші ацетонітрила з водою при технологічно сприйнятливих співвідношеннях масових частин [2,3] Технічна еволюція означених об'єктів здійснювалася пошуком найефективніших умов обробки рідини на підготовчих фазах, екстрагентів та елюентів для рідинної хроматографії Але використання ХІМІЧНИХ засобів в рідинній хроматографії не дозволяє підвищити ступінь екс ю 45279 тракцм еуфіліну з-поза присутності останніх в розчинах, як зайвих домішок, а також залишається недостатнім для забезпечення оптимальних рівнів поляризації, активності елюенту, тривалості інтервалів між періодами утримання аналізата в суміші тощо Разом із цим, відомим об'єктам притаманні понадмірні тривалість підготовки проби до аналізу та вартість обладнання, що є необхідним для відтворення способів (див Табл 1) Тільки термін підготовки аналізату до випробувань (час екстракції, центрифугування, випаровування до 1,5мл, випаровування насухо, фільтрації) сягає близько 110хв, а вартість обладнання для здійснення рідинної хроматографії становить понад 18, а деякого більше ЮОтис ум од Вдосконалення відомих способів мало значення лише для вже запроваджених технологій Рівень техніки, який встановлений заявником, інформує про відсутність інших об'єктів аналогічного призначення, які б за сукупністю ознак більше співпадали з об'єктом, що заявляється У основу винаходу поставлена задача розробити такий спосіб визначення еуфіліну у водному розчині, в якому шляхом капілярного електрофорезу підвищуються ступінь екстракції аналізату, чутливість, економічність та знижується термін визначення при використанні Означений технічний результат досягається тим, що у способі визначення вмісту еуфіліну у водному розчині, що містить фільтрацію та центрифугування проби, згідно з винаходом, заздалегідь приготовляють перший, другий і третій буферні розчини, після фільтрації пробу змішують з третім буферним розчином, як активатором еуфіліну, та центрифугують зі швидкістю 2000 6000об/хв протягом 2 - бхв, надалі між пробою та другим буферним розчином, як електролітичним середовищем, встановлюють капілярну трубку, з можливістю підтримки внутрішнього тиску на рівні ЗОмБар протягом 15сек, підводять до них потенціали високовольтного джерела напругою 20кВ, комутують ланцюги живлення, реєструють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби під час її переміщення крізь капілярну трубку, ідентифікують та визначають вміст еуфіліну шляхом перетворення даних в аналоговий сигнал, при умовах, що перший буферний розчин містить борну кислоту, тетраборат натрію та воду дистильовану, при наступному співвідношенні інгредієнтів, см борна кислота при концентрації 0,2 моль/дмЗ 5,5 тетраборат натрію при концентрації 0,05 моль/дмЗ 6,5 вода дистильована 38,0 що другий буферний розчин містить поряд з першим буферним розчином д од еци л сульфат натрію та воду дистильовану, при наступному співвідношенні інгридієнтів, см перший буферний розчин 25,0 додецилсульфат натрію при концентрації 0,2моль/дм3 10,0 вода дистильована 15,0 що третій буферний розчин утримує другий буферний розчин і воду дистильовану у співвідношенні 1 10 Виготовлення буферних розчинів дозволяє отримати та підготовити форетичне середовище до експлуатації, відтворити умови динамічного переміщення аналізата в порожнині капілярної трубки, покращити виявлення КІЛЬКІСНИХ часток, що підлягають реєстрації Центрифугування проби передбачає застосування найбільш оптимальних режимів впливу на ПІДГОТОВЧІЙ фазі Так, при центрифугуванні и зі швидкістю менше 2000об/хв відбуваються наслідки недостатньої дегазації аналізату, а при швидкості понад 6000об/хв - пробірка Еппендорфа з пробою не витримує зусиль центробіжних навантажень Центрифугування проби протягом менше 2хв супроводжується замалою дегазацією проби, а використання більш тривалого терміну дегазації, наприклад, понад бхв - недоцільно технологічно та вважається межею досягнення ефекту Змішування проби з третім буферним розчином дозволяє активізувати динаміку еуфіліну перед міграцією, завдяки зв'язку з зарядженими міцелами д од еци л сульфату натрію, а від того - забезпечує рух часток еуфіліну, що підлягають реєстрації, в бік до аноду під впливом електричного поля Розміщення капілярної трубки між пробірками з пробою і другим буферним розчином як електролітичним середовищем, разом із високовольтним джерелом напруги та ланцюгами живлення сприяє відтворенню електрофорезу, тобто умов, що виключають використання зайвих домішок для ідентифікації та визначення еуфіліну Підтримка тиску в капілярній трубці на рівні ЗОмБар при експозиції у 15сек, надає змогу оптимізувати чутливість детектора під час ідентифікації аналізата Відхилення від наданих технологічних режимів є недоцільним, бо в разі зменшення значень цих параметрів погіршується чутливість детектора та умов ідентифікації еуфіліну, а при збільшенні - стримується ввід аналізата в капіляр, а від так - відбувається спотворення результатів Використання високовольтного джерела напругою 20кВ зумовлює необхідну швидкість руху часток проби в капілярній трубці під час відтворення форетичного процесу В разі зниження напруги джерела живлення збільшується термін виходу аналізата, а при підвищенні - спотворюються результати ідентифікації та визначення КІЛЬКОСТІ шуканого агента в пробі Між ТИМ, реєстрація оптичної ЩІЛЬНОСТІ еуфіліну, активовані молекули якого рухаються крізь капілярну зону у форетичному середовищі, з подальшим перетворенням даних в аналоговий сигнал, дозволяє визначити аналізат у чистому вигляді, без використання зайвих домішок в пробі, та істотно скорочує тривалість досліду Досягнення означеного вище технічного результату додатково зумовлене утримуванням першим буферним розчином борної кислоти, тетрабората натрію та води дистильованої в технологічно прийнятному співвідношенні об'ємних частин 5,5 6,5 38,0(см3), бо має вплив на полярність форетичного середовища При цьому, утримування першого буферного розчину у другому, у вигляді суміші з додецил-сульфатом натрію та водою дистильованою при технологічно прийнятному співвідношенні об'ємних частин 25 10 15(см3) активує форетичний рух нейтральних молекул еуфіліну в капілярній трубці, оскільки регу 45279 лює звязок останніх з зарядженими міцелами додеци л сульфата натрію при міграції до анода Зниження КІЛЬКОСТІ додеци л сульфата натрію в розчині, як електролітичному середовищі, може погіршити активність власних міцел, а завищена присутність виснажує електролітичний носій при використанні Між тим, розбавлення другого буферного розчину водою дистильованою у співвідношенні 1 10 оптимізує чутливість ідентифікації та детектування оптичної ЩІЛЬНОСТІ Збільшена концентрація форетичного середовища збігається до утворення помилок, а зменшена - запобігає потраплянню проби до капілярної трубки та и переміщенню в порожнині останньої, стає чинником невідтво-рюваності форетичного процесу Буферні розчини в загалі забезпечують поляризацію проби, електролітично-форетичні функції капілярного електрофорезу Сукупність наданих ознак відбиває технологічні умови ідентифікації, реєстрації та визначення вмісту еуфіліну в пробі, для яких виключення необхідності додання допоміжних домішок до проби вважається вельми характерним, і має зв'язок з підвищенням ступеня екстракції аналізата, чутливості, економічності та зниженням терміну визначення при використанні Отже, сукупність відокремлюючих ознак заявленого об'єкта за наявністю причинно-слідчих зв'язків з технічним результатом можливо кваліфікувати суттєвою Для визначення еуфіліну у водному розчині застосовували промислову систему капілярного електрофорезу «Капель- 103Р» (виробництва РФ), кварцовий капіляр 0 0,075 мм і довжиною 600 мм, ваги лабораторні 2 класу, міри маси, дозатори піпеточні змінних обсягів (5 - 50мм3, 50 - 200мм3, 200 - 1000мм3), рН метр, програмне забезпечення «Мультіхром» і комп'ютер мінімальної конфігурації Допускається використання приладів і устаткування інших моделей з аналогічними або більш кращими метрологічними характеристиками ДОПОМІЖНІ пристрої центрифуга, що забезпечує швидкість 2000 - 6000об/хв, пробірки одноразові типу Еппендорфа, МІСТКІСТЮ 1,5СМ3, фільтри целюлозно-ацетатні, з діаметром пір біля 20мкм, насадки фільтра Реактиви вода дистильована, додецилсульфат і гідроксид натрію, борна кислота, натрій тетрабо.рнокислий, з молярною концентрацією еквівалентів не менше 0,1моль/дм3 Спосіб визначення вмісту еуфіліну у водному розчині виконують у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ Заздалегідь приготовляють перший, другий та третій буферні розчини Перший буферний розчин формують шляхом змішування борної кислоти, тетрабората натрію та води дистильованої, другий - шляхом додання до нього додеци л сульфата натрію та води дистильованої, третій - шляхом розчинення другого буферного розчину водою дистильованою, при технологічно сприйнятливих співвідношеннях масових частин інгредієнтів всіх буферів Після фільтрації проби у пробірку додають третій буферний розчин і центрифугують для дегазації у оптимальнішому технологічно режимі Між пробою та електролітичним середовищем, функцію якого виконує другий буферний розчин встановлюють порожнистий транспортувальний провідник, а саме капілярну трубку, забезпечують в ній необхідний режим внутрішнього тиску та підводять потенціали високовольтного живлення Після комутації електричних ланцюгів живлення нейтральні молекули еуфіліну мігрують від пробірки до другого буферу крізь капілярний провідник, завдяки взаємодії із зарядженими міцелами додецилсульфата натрію під впливом електричного струму За допомогою детектора, що розміщується впритул до капіляра, ідентифікують та реєструють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби шляхом перетворення даних в аналоговий сигнал та визначають вміст еуфіліну в пробі Тож, спосіб дозволив шляхом капілярного електрофорезу визначитиіміст аналізата в пробі, а разом із цим - посилити степінь екстракції аналізата, чутливість, економічність та знизити термін його визначення, завдяки усуненню впливу чинників низької поляризації, дисбаланса періодів утримання еуфіліну в елюенті та зайвих домішок під час проведення рідинної хроматографії (див таблицю) До додаткових переваг запропонованого рішення задачі над прототипом належать зниження токсичності ХІМІЧНИХ реактивів, матеріальних витрат, що пов'язані з придбанням останніх, КІЛЬКІСНИХ витрат реактивів, собівартості дослідження, терміну підготовки проби, підвищення рівня автоматизації, оптимізаци технологічних режимів, спрощення умов відтворення способу й т і Для перевірки технічного результату на прикладі конкретного використання у модельному водному розчині визначали вміст еуфіліну в наступній ПОСЛІДОВНОСТІ Для виготовлення першого буферного розчину у мірну колбу МІСТКІСТЮ 50см 3 додавали 5,5см3 розчину борної кислоти при концентрації 0,2моль/дм3, 6,5см3 розчину тетрабората натрію при концентрації 0,05моль/дм3, а потім обсяг доводили до мітки дистильованою водою Другий буферний розчин складали з першого буферного розчину, додецилсульфата натрію та води дистильованої У мірну колбу МІСТКІСТЮ 50СМ вміщували 25см 3 першого буферного розчину, 10см розчину додецилсульфата натрію при концентрації 0,2моль/дм3, з наступним доведенням обсягу до мітки дистильованою водою Термін зберігання розчинів в судинах з поліетилену складав 1 місяць Безпосередньо перед вимірюваннями, другий буферний розчин розбавляли водою дистильованою у співвідношенні 1 10 Для підготовки проби до аналізу и фільтрували через целюлозно-ацетатний фільтр, заздалегідь промитий дистильованою водою У пробірку Еппендорфа відбирали 0,3см3 аналізата й додавали 0,3см3 третього буферного розчину, перемішували та дегазували на центрифузі протягом 5хв зі швидкістю 4000об/хв Між пробірками з пробою та другим буферним розчином, як електролітичним середовищем, встановлювали капілярну трубку Перед підведенням до них потенціалів високовольтного джерела напругою 20кВ, в порожнині капіляра протягом 15сек утворювали тиск, що дорівнював ЗОмБар дискретно Комутували ланцюги живлення Нейтральні молекули еуфіліну під впливом електричного струму рухались до аноду у форетичному середовищі крізь капіляр На довжині хвилі детектора 254нм, що контактував із капілярною трубкою, ідентифікували еуфілін та визначали КІЛЬКІСТЬ останнього в пробі шляхом перетворення оптичної ЩІЛЬНОСТІ потоку в аналоговий сигнал Сигнал з приладу надходив до комп'ютера та відбивався у вигляді електрофореграми Побудова градуїровочної залежності, з використанням значень шуканого агента між верхньою та нижньою межами виявлення, визначення площ ПІКІВ заданої концентрації дозволили визначити концентрацію 8 45279 еуфіліну в пробі Загальна межа виявлення еуфіліну (чутливість) у модельному водному розчині становила 30нг/мл, його екстракція сягала 100%, час виходу 5хв, а термін аналізу - 7хв Отже, на прикладі конкретного використання об'єкта доведена можливість перевершення технічного результату, що був відомий заявнику з рівня техніки Використання способу визначення вмісту еуфіліну у водному розчині науково-дослідними лабораторіями фармаційних та ХІМІЧНИХ підприємств допоможе знизити собівартість вимірів при 100% вірогідності визначення шуканого агента, з можливістю своєчасного корегування вмісту даного фармакологічного засобу в лікарській формі Таблиця Техніко-економічне порівняння шляхів капілярного електрофорезу та рідинної хроматографії для визначення вмісту еуфіліну в ХІМІЧНИХ сполуках Показники Заявлене рішення задачі Прототип Загальна тривалість пробопідготовки, хв 7 ПО -термін екстракції еуфіліну, хв не потрібний 25 -термін центрифугування, хв 5 60 -термін випаровування до 1-5 мл, хв не потрібний 10 -термін випаровування насухо, хв не потрібний 10 2 5 12 114 11 000 18000 ЗО 100 1,00 0,85 -термін фільтрації, хв Загальний термін аналізу, хв Загальна вартість обладнання, ум од Чутливість визначення еуфіліну в пробі, нг/ мл Ступінь екстракції еуфіліну, од Література 1 Машковский М Д Лекарственные средства В двух томах Т 1 Изд 10-е, стереотипное М «Медицина», 1987, с 457 2 Крамаренко В Ф Токсикологічна ХІМІЯ К «Вища школа», 1989, 446с З http//ilch vsmu edu ua/hplc/dmg/l-0002 htm - Интернет-сайт совместной медикобиоло-гической лаборатории Винницкого государственного университета им Н И Пирогова и Института поверхности НАН Украины Теофиллин (Updated 10 09 2001) ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90