Спосіб приготування готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії

Спосіб приготування готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, який включає одержання ефіру інсуліну людини транспептидацією свинячого інсуліну надлишком ди-трет-бутилового ефіру треоншу у водно-органічному середовищі в присутності трипсину, хроматографічне очищення отриманого ефіру, зняття захисних груп, кристалізацію інсуліну людини, його наступне розчинення в розбавленій кислоті, додавання кислих розчинів ІОНІВ цинку і протамінсульфату, змішування з забуференими розчинами m-крезолу, фенолу і гліцерину, витримування розчину до утворення кристалів, який відрізняється тим, що реакцію транспептидацм проводять за молярного надлишку ди-трет-бутилового ефіру треоншу від більш ніж 100 до 500 та за вагового співвідношення трипсину і свинячого інсуліну від 1 до 300-1000, реакційну суміш розбавляють водою у 2-3 рази, проводять очищення ефіру інсуліну людини та отриманого після прямої кристалізації інсуліну людини рідинною хроматографією високого тиску і наступне розчинення кристалів інсуліну в розбавленій кислоті проводять поетапно, причому спочатку одержують дрібнодисперсну суспензію кристалів інсуліну у воді, потім до неї додають розбавлену кислоту і суміш, одержану після змішування з забуференими розчинами m-крезолу, фенолу і гліцерину, витримують за температури 18-21 °С протягом 20-22 годин Винахід відноситься до хіміко-фармацевтичної промисловості і може бути використаний у виробництві високоякісних готових лікарських форм інсулінів пролонгованої дії Відомий спосіб одержання фармацевтичного препарату свинячого інсуліну, який включає водноспиртову екстракцією підшлункової залози тварин, очищення одержаного екстракту від баластних білків, приготування концентрованого розчину інсуліну в присутності натрію хлориду, натрію ацета Найбільш близьким до способу, який заявляється, є спосіб одержання готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, згідно з яким спочатку одержують ефір інсуліну людини транспептидацією свинячого інсуліну з супутніми спорідненими домішками у водно-органічному середовищі в присутності трипсину та органічної кислоти, яку проводять за молярного надлишку дітрет-бутилового ефіру треоншу по відношенню до свинячого інсуліну більш ніж 5 та за вагового співвідношення трипсину і свинячого інсуліну від 1 до 1 - 200, потім інгібують реакцію створенням кислого середовища з рН 3, очищують одержаний ефір інсуліну людини аніонною та/або катіонною хроматографією, знімають захисні групи відомим способом трифтороцтовою кислотою, після чого проводять кристалізацію сирого інсуліну людини, одержані кристали розчиняють в розбавленій кислоті, додають кислі розчини ІОНІВ цинку і протамінсульфату, змішують з забуференими розчинами m-крезолу, фенолу і гліцерину та витримують одержану суміш до утворення суспензії кристалів го ту, відповідної КІЛЬКОСТІ ІОНІВ цинку та затравки, з наступним розбавленням цієї суміші у 10 разів (Schhchtkrull J (1956 b) Insulin Crystals IV The Preparation of nuclei, seeds and monodisperse insulin crystal suspensions Acta ChemScand 11 299 302) Отримана за таким способом готова лікарська форма інсуліну містить велику КІЛЬКІСТЬ ШКІДЛИВИХ для здоров'я людини домішок, які викликають небажані алергічні реакції та ускладнення Окрім того, для такого способу характерні значні втрати інсуліну у процесі виробництва (О (О (О 46669 тової лікарської форми (Galenics of Insulin Preparaні в прототипі, тобто осадження реакційної суміші, tions J Brange etal, стр 31, 66) Цей спосіб довідокремлення осаду центрифугуванням, розчизволяє збільшити вихід ефіру інсуліну людини, нення осаду Необхідність виконання таких операякий визначає вихід інсуліну людини в процесі вицій також усувається і після зняття захисних груп робництва, до 60% (а за певних умов і навіть до завдяки прямій кристалізації 90%), і суттєво знизити КІЛЬКІСТЬ ШКІДЛИВИХ ДОМІОкрім того, використання системи ВЕРХ доШОК до (до 7%) зволяє ефективно відокремити ефір інсуліну людини від свинячого інсуліну, який не прореагував, Але недоліками цього способу все ще залита домішок-супутників реакції транспептидацм шаються досить високі імунологічні властивості готової лікарської форми та значні втрати інсуліну Заключне очищення кінцевого продукту перу процесі виробництва шої стадії процесу - інсуліну людини, який одержується після зняття захисних груп відомим спосоЗавданням винаходу є створення ефективнобом трифтороцтовою кислотою та прямої го, економічного способу приготування готової кристалізації інсуліну людини, також проводиться лікарської форми інсуліну пролонгованої дії з нина колонці системи високоефективної рідинної зькими імунологічними властивостями, який гаранхроматографії і дозволяє досягти ще кращих ретує збільшення виходу інсуліну в процесі виробнизультатів цтва Поставлене завдання вирішується тим, що у Умови реакції транспептидацм (ферментспособі приготування готової лікарської форми субстратне співвідношення та молярний надлишок інсуліну пролонгованої дії, який включає одержандікрет-бутилового ефіру треоншу) на першій стадії ня ефіру інсуліну людини транспептидацією свиприготування готової лікарської форми інсуліну нячого інсуліну надлишком ді-трет-бутилового людини, які відзначають рішення, що заявляється, ефіру треоншу у водно-органічному середовищі в дозволяють збільшити ступінь конверсії свинячого присутності трипсину, хроматографічне очищення інсуліну або вихід ефіру інсуліну людини, який хаотриманого ефіру, зняття захисних груп, кристалірактеризує вихід кристалів інсуліну людини, до зацію інсуліну людини, його наступне розчинення в 98% та зменшити КІЛЬКІСТЬ ДОМІШОК, котрі важко розбавленій кислоті, додавання кислих розчинів усуваються, до 1,5% На ще більший ступіть усуІОНІВ цинку і протамінсульфату, змішування з занення домішок спрямоване і додаткове очищення буференими розчинами m-крезолу, фенолу і гликристалів інсуліну людини - до 0,9% церину, витримування суміші до утворення крисНа другій стадії приготування готової лікарсьталів, реакцію транспептидацм проводять за кої форми отримані кристали інсуліну людини розмолярного надлишку ді-трет-бутилового ефіру чиняють у розбавленій кислоті поетапно спочатку треоншу від більш ніж 100 до 500 та за вагового їх суспендують у воді і добре перемішують до співвідношення трипсину і свинячого інсуліну від 1 одержання дрібнодисперсної суспензії, а потім до 300 -1000, реакційну суміш розбавляють водою додають до неї 1М НСІ Приготування дрібнодису 2 - 3 рази, проводять очищення ефіру інсуліну персної суспензії на першому етапі, тобто коли людини та отриманого після прямої кристалізації кожна окрема дрібна частка інсуліну виявляється інсуліну людини рідинною хроматографією високовже з усіх боків оточеною водою, створює умови го тиску, наступне розчинення кристалів інсуліну в для їх швидкого розчинення у розбавленій кислоті розбавленій кислоті проводять поетапно, причім на другому етапі Таким чином, час контакту крисспочатку одержують дрібнодисперсну суспензію талів інсуліну з кислотою зменшується, що, згідно кристалів інсуліну у воді, потім до неї додають з дослідженнями авторів, призводить до зменшенрозбавлену кислоту, і суміш, одержану після зміня утворення А21-дезаімду інсуліну, а отже до збішування з забуференими розчинами т-крезолу, льшення чистоти готової лікарської форми Потім фенолу і гліцерину, витримують за температури 18 додають кислі розчини ІОНІВ цинку та протамінсу- 21 °С протягом 20 - 22 годин льфату, змішують з забуференими розчинами, які обов'язково містять і m-крезол, і фенол, а також Супутніми спорідненими домішками до свинягліцерин Одержаний розчин витримують за темчого інсуліну являються свинячий проінсулін та ператури 18 - 21 °С протягом 20 - 22 годин Такий продукти модифікації і деградації свинячого інсурежим вирощування кристалів дозволяє одержати ліну кристалічну суспензію з більш однорідними за Водно-органічне середовище являє собою ворозміром, ніж в прототипі, кристалами тетрагонаду з сумішшю апротонних (наприклад, діметілацельної форми довжиною від 1 до 25мкм (в прототипі тамід) та протонних (наприклад, 1,2 етандюл, 1,4 довжина кристалів сягає від 1 до бОмкм), що забутандюл, 1,5 пентадюл) розчинників безпечує більш рівномірне вивільнення інсуліну в Трипсин у представленому технічному рішенні організмі людини, тобто забезпечує одержання може бути свинячим або бичачим ЛІКІВ більш високої якості В реакції транспептидацм може використовуватися ді-трет-бутиловий ефір треоншу або його Вирішення поставленого завдання ілюструєтьсіль ся прикладами конкретного виконання Розбавлення реакційної суміші водою в 2 - З Приклад 1 рази дозволяє безпосередньо наносити розбавле6г сирого свинячого інсуліну суспендували в ну суміш на колонку системи рідинної хроматог24мл води, додавали 3,0мл оцтової кислоти, рафії високого тиску або, як вона ще називається, 180мл 0,7М ді-трет-бутилового ефіру треоншу в системи високоефективної рідинної хроматографії суміші діметілацетаміду та 1,4 бутандюлу, 19мг (ВЕРХ), що спрощує спосіб та усуває необхідність трипсину в 12мл 0.05М кальцію ацетату, реакційну виконання ряду технологічних операцій, які описасуміш перемішували протягом 16 годин за темпе 46669 ратури 23°С Реакцію інгібували розбавленням водою у два рази по відношенню до об'єму реакційної суміші і рН суміші доводили до 2,5 10% НСІ Розбавлену реакційну суміш фільтрували через фільтр з розміром пор 0,2мкм для нанесення на колонку системи ВЕРХ В якості нерухомої фази використовували сорбент DAISOGEL ODS (С 18) з розміром часток 15мкм і розміром пор 120А Для рухомої фази використовували 0.06М гліцин-НСІ буфер, який містив 0,015М амонію сульфату і пропанолу-2 з концентрацією від 20 до 35% за рН 2,5 Фракцію ефірної похідної осаджували в присутності ІОНІВ цинку за рН від 6,8 до 7,0, центрифугували, одержаний осад промивали водою та сушили у вакуумній сушильній шафі 5,0г одержаного ефіру інсуліну людини розчиняли в 60мл трифтороцтової кислоти, витримували суміш протягом 40 хвилин за температури 25°С, трифтороцтову кислоту відгонили на роторному випарнику за температури не вище ніж 30°С, одержаний інсулін людини розчиняли у воді і проводили пряму цитратну кристалізацію за рН 5,8 Кристалічну суспензію фільтрували, кристали промивали водою, розчиняли в 0.25М оцтовій кислоті та наносили на колонку системи ВЕРХ В якості рухомої фази використовували 0.05М ацетатний буфер, який містив пропанолу-2 від 10 до 20% за рН 2,5 Фракцію інсуліну людини кристалізували за рН 5,8, суспензію кристалів фільтрували, промивали водою та ліофільно висушували Вихід інсуліну людини склав 5,0г Методом імуноферментного аналізу було встановлено, що залишок свинячого проінсуліну у отриманому інсуліні людини становив 0,1 - 1мкг/г Щодо інших споріднених домішок, то за допомогою аналітичної системи ВЕРХ був встановлений їх вміст - 0,85% Отриманий інсулін людини помістили в 320мл води, а потім добре перемішали до одержання дрібнодисперсної суспензії, додали 1М НСІ в такій КІЛЬКОСТІ, щоб рН розчину був не нижче 3,1 0,355г протамінсульфату розчинили у 58,4мл води, додаючи 1М НСІ до такого ж рН 0,0252г цинку хлориду додали у розчин протамінсульфату Потім змішали всі приготовані кислі розчини Далі приготували буферний розчин з 5,88г натрію фосфорнокислого однозаміщеного двоводного в 2,32л води, додали ще 44,8г гліцерину, 5,25г m-крезолу і 2,1г фенолу та перемішували протягом ЗО хвилин і рН суміші довели до 7,8 Далі буферний розчин піддали стерилізуючій фільтрації і профільтрували туди суміш кислих розчинів протамінсульфату, цинку хлориду та інсуліну Отриману суміш витримували, перемішуючи, за температури 20°С протягом 21 години для одержання кристалічної суспензії готової лікарської форми Форму та розмір одержаних кристалів визначали за допомогою мікроскопа при 400-кратному збільшенні Кристали мали тетрагональну форму і довжину від 3 до 21мкм Дослідження препарату пролонгованої дії за допомогою аналітичної системи ВЕРХ показали, що препарат має загальну активність 40МО/мл, вміст високомолекулярних сполук 0,4%, споріднених супутніх домішок 0,8%, А21-дезаміду інсуліну 0,4%, активність супернатанту складає 0,ЗМО/мл Приклад 2 Умови одержання кристалів інсуліну людини та готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, як в прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії процесу додали ЗОмгтрипсину в 12мл 0.05М кальцію ацетату, а реакцію проводили протягом 10 годин за температури 23°С Вихід інсуліну людини склав 3,36г, а за даними ВЕРХ КІЛЬКІСТЬ супутніх споріднених домішок у ньому дорівнювала 4,2% Дослідження препарату пролонгованої дії згідно з прикладом 2 за допомогою аналітичної системи ВЕРХ показали, що препарат має активність 39,2МО/мл, вміст високомолекулярних сполук 0,7%, споріднених супутніх домішок 4,1%, А21дезаміду інсуліну 2,0%, активність супернатанту складає 0,4МО/мл Довжина кристалів складала 2 -23мкм Приклад З Умови одержання кристалів інсуліну людини та готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, як в прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії процесу додали 4,8мг трипсину в 12мл 0.05М кальцію ацетату, а реакційну суміш перемішували протягом 20 годин за температури 20°С Вихід кристалів інсуліну людини склав 3,00г Дослідження препарату пролонгованої дії згідно з прикладом 3 показали, що препарат має активність 38,5МО/мл, вміст високомолекулярних сполук 0,8%, споріднених супутніх домішок 1,8%, А21дезаміду інсуліну 0,8%, активність супернатанту складає 0,5МО/мл Довжина кристалів складала 2 -25мкм Приклад 4 Умови одержання кристалів інсуліну людини та готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, як в прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії процесу додали 180мл 0,51 М ді-третбутилового ефіру треоншу в суміші діметілацетаміду та 1,5 пентадюлу Вихід інсуліну людини склав 2,75г, а КІЛЬКІСТЬ СВИНЯЧОГО інсуліну, який не прореагував, дорівнювала 20% Дослідження препарату пролонгованої дії згідно з прикладом 4 показали, що препарат має активність 39,ЗМО/мл, вміст високомолекулярних сполук 0,8%, споріднених супутніх домішок 1,6%, А21-дезаміду інсуліну 0,8%, а активність супернатанту складає 0,35МО/мл Довжина кристалів складала 1 25мкм Приклад 5 Умови одержання кристалів інсуліну людини та готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, як в прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії процесу додали 180мл 1.29М ді-третбутилового ефіру треоншу в суміші діметілацетаміду та 1,4 бутандюлу Вихід інсуліну людини склав 3,06г Дослідження препарату пролонгованої дії згідно з прикладом 5 показали, що препарат має активність 39,ЗМО/мл, вміст високомолекулярних сполук 0,75%, споріднених супутніх домішок 1,3%, А21-дезаміду інсуліну 1,1%, активність супернатанту складає 0,54МО/мл Довжина кристалів складала 2 - 24мкм Приклад 6 Умови одержання кристалів інсуліну людини та готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії, як в прикладі 1, за винятком того, що розчин, одержаний після змішування з забуференими роз 8 46669 чинами m-крезолу, фенолу і гліцерину витримуваних сполук, споріднених супутніх домішок, А21ли за температури 14°С Дослідження препарату дезаміду інсуліну, активність супернатанту були на пролонгованої дії згідно з прикладом 6 показали, рівні, описаному в першому прикладі, але в межах що активність препарату, вміст високомолекулярпомилки визначення КІЛЬКІСТЬ кристалів з довжиних сполук, споріднених супутніх домішок, А21ною від 1 до 25мкм складала тільки 55% дезаміду інсуліну, активність супернатанту були на Приклад 9 рівні, описаному в першому прикладі, але в межах Умови одержання кристалів інсуліну людини помилки визначення Однак при цьому 95% криста готової лікарської форми інсуліну пролонгованої талів мали довжину від 1 до 55мкм дії, як в прикладі 1, за винятком того, що розчин, одержаний після змішування з забуференими розПриклад 7 чинами m-крезолу, фенолу і гліцерину витримуваУмови одержання кристалів інсуліну людини ли протягом 25 годин Дослідження препарату та готової лікарської форми інсуліну пролонгованої пролонгованої дії згідно з прикладом 9 показали, дії, як в прикладі 1, за винятком того, що розчин, що активність препарату, вміст високомолекуляродержаний після змішування з забуференими розних сполук, споріднених супутніх домішок, А21чинами m-крезолу, фенолу і гліцерину витримувадезаміду інсуліну, активність супернатанту були на ли за температури 25°С Дослідження препарату рівні, описаному в першому прикладі, але в межах пролонгованої дії згідно з прикладом 7 показали, помилки визначення КІЛЬКІСТЬ кристалів з довжищо активність препарату, вміст високомолекулярною від 1 до 25мкм складала 95% Такий же рених сполук, споріднених супутніх домішок, А21зультат одержують і коли розчин витримують 22 дезаміду інсуліну були на рівні, описаному в пергодини, тобто тут просто процес одержання готошому прикладі, але в межах помилки визначення вої лікарської форми необ ґрунтова не затягується Довжина кристалів дорівнювала від 1 до 50мкм і активність супернатанту становила 1,2М0/мл, що Таким чином, аналіз виконаних прикладів посвідчило про неповний процес кристалізації казує (приклади 2 - 5 та 6 - 9), що недодержання діапазонів величин, які заявляються, призводить Приклад 8 до погіршення характеристик готових лікарських Умови одержання кристалів інсуліну людини форм, до збільшення втрат інсуліну в процесі вита готової лікарської форми інсуліну пролонгованої робництва або до необ ґрунтова ного затягування дії, як в прикладі 1, за винятком того, що розчин, процесу виробництва, тобто зниження його ефекодержаний після змішування з забуференими розтивності А додержання діапазонів величин, які чинами m-крезолу, фенолу і гліцерину витримувазаявляються (приклад 1), дозволяє одержати еколи протягом 17 годин Дослідження препарату номічнім та високоефективним способом препарат пролонгованої дії згідно з прикладом 8 показали, зі зниженими імунологічними властивостями що активність препарату, вміст високомолекуляр ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71