Спосіб одержання препарату інсуліну пролонгованої дії

Спосіб одержання препарату інсуліну пролонгованої дії, що включає водно-спиртову екстракцію підшлункової залози тварин, іонообмінну хроматографію, хроматографічне відділення проінсуліну та інших баластних білків, розчинення очищеного інсуліну в кислому водному середовищі з вмістом консерванту та рН-регулюючих сполук, який відрі 33799 парат інсуліну пролонгованої дії отримували шляхом розчинення отриманої субстанції в розчині соляної кислоти, а також цинковій обробці інсуліну з використанням розчинів цинку хлористого або окису цинку, натрію хлориду з добавленням консерванту ("Регламент производства инсулина лонга и инсулина-ультралонга", М.,1982). Основні недоліки методу: невисокий вихід інсуліну, невизначеність якості спиртового екстракту підшлункової залози, багатостадійність, трудоємність і енергоємність, неекономічний метод концентрування, дуже низька продуктивність (50 мл/год), значні витрати інсуліну для приготування його готової лікарської форми. Метою винаходу є розробка високоефективного, економічного, науковоємного, швидкого і високопродуктивного способу одержання високоочищеного інсуліну свиней або великої рогатої худоби з характеристиками субстанції інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5-99,2 % (як правило 98,8-99,3%), вміст проінсуліну - не більше 10 ррМ (як правило, 0,5-5,0 ррМ), вміст інших баластних білків - не більше 1%, і препарату інсуліну пролонгованої дії: вміст інсуліну високоочищеного свиного або телячого або їх суміші - 36-42 ОД, натрію хлориду- 6,5-7,5, натрію оцтовокислого 1,25-1,45 мг, цинку хлориду- 0,05-0,10 мг або окису цинку, консерванту, наприклад ніпагіну - 0,91,4 мг, води високочищеної для ін'єкцій - до 1мл. Поставлена мета досягається тим, що подрібнену підшлункову залозу екстрагують 60-85%ним спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітом, відмивання баластних білків проводять амонійноацетатним буфером з рН 6,0, а елюцію проводять 0,1-1,0 М бікарбонатним буфером з рН 6,59,0. Відділення проінсуліну і інших полімерних білків проводять на сорбенті на основі силікагелю з прищепленими гексадецильними групами, а як елюєнт використовують водні розчини з вмістом ізопропілового спирту (10-50%) і оцтової кислоти (0,1-5,0%). Очищення від дезамідованих і інших форм інсуліну проводять В градієнті водно-органічного елюєнту з вмістом оцтової кислоти від 0,2 до 0,8%. Приготування препарату інсуліну пролонгованої дії здійснюють шляхом отримання суспензії високоочищеного монокомпонентного інсуліну з застосуванням спеціальної технології і використанням розчинів монокомпонентного інсуліну, натрію хлориду, натрію оцтовокислого, цинку хлориду або окису цинку, ніпагіну або інших консервантів, води для ін'єкцій. Суть способу закладена в дво-тристадійній обробці підшлункової залози: - на першій стадії видаляють основні баластні білки шляхом водно-спиртового екстрагування підшлункової залози з наступною іонообмінною хроматографією на колонці з сульфокатіонітом і елююванням 0,1-1,0 М бікарбонатним буфером з рН 6,5-9,0, що дозволяє підвищити на 5-12% вихід інсуліну, одержують інсулін-сирець з вмістом інсуліну на рівні 90-93%; - на другій стадії, видаляють проінсулін і полімерні білки хроматографією розчину інсулінусирцю, що містить ізопропіловий спирт і оцтову кислоту, на колонці (10х30 см) з Діасорбом-130С16Т, 20 мкм. Елюювання здійснюють тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Далі інсулін можна кристалізувати і висушивати до вмісту води не більше 10%, одержуючи (вихід не менше 80%) кристалічний інсулін з вмістом основної речовини не менше 95% і вмістом проінсуліну - не більше 5 ррМ; - на третій стадії інсулін, одержаний на стадії 2, вносять в розчин, що містить 5-50% етанолу (ацетонітрилу, ізопропілового спирту) і 0,1- 5,0% оцтової кислоти. Наносять на колонку (15х30 см), упаковану сорбентом Діасорбом-130-С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 год із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 12% етанолу, 0,3% оцтової кислоти у воді; буфер Б: 50% етанолу, 0,3% оцтової кислоти. Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ). Після аналізу об'єднують фракції з вмістом інсуліну не менше 98%. Об'єднані фракції інсуліну кристалізують (вихід не менше 90%) і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують кристалічний інсулін з вмістом основної речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 5 ррМ, дезамідованих форм інсуліну - не більше 0,3%, високомолекулярних білків - не більше 0,3%. Фракції з вмістом основної речовини від 30 до 98% об'єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3; - на четвертій стадії отримують препарат інсуліну пролонгованої дії шляхом спеціальної технології суспензування кристалічного високоочищеного монокомпонентного інсуліну з використанням компонентів у такому співвідношенні: вміст інсуліну високоочищеного монокомпонентного свиного або телячого або їх суміші- 36-42 ОД, натрію хлориду- 6,5-7,5, натрію оцтовокислого- 1,25-1,45 мг, цинку хлориду- 0,05-0,10 мг або окису цинку, консерванту, наприклад ніпагіну- 0,91,4 мг, води високочищеної для ін'єкцій - до 1мл. Основні переваги запропонованого способу порівняно з прототипом: - зменшено кількість операцій: одна операція при виділенні і дві операції при очищенні цільового продукту, що в свою чергу значно здешевлює весь процес і скорочує в 180 (!) разів час його проведення; - на першій стадії, робочі об'єми зменшуються практично у 15 разів, що спрощує технологію і суттєво полегшує дотримання санітарних норм виробництва; - вміст білкових домішок в інсуліні, одержаному запропонованим способом, набагато нижче, ніж у кращих зразках закордонного виробництва; - препарат інсуліну пролонгованої дії забезпечує високу терапевтичну ефективність, стабільність суспензії після струшування, "м'яку" дію препарату, надійність дії консерванту і повну нетоксичність останнього. Метод простий і оригінальний в реалізації, не потребує значної кількості дорогого обладнання. Запропонований спосіб відрізняється значною 2 33799 наукоємністю як за видом матеріалів і обладнання, що використовується, так і за змістом і типом технологічних операцій. Приклад. Одержання препарату інсуліну пролонгованої дії. Стадія 1. 0,4-1,0 тони підшлункової залози великої рогатої худоби або свиней подрібнюють, екстрагують 60-85% спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітом КУ-23 або Macro-Prep high S support, Bio-Rad USA, 50 мкм, відмивку баластних білків проводять амоній-ацетатним буфером з рН 6,0, елюювання здійснюють 0,5М бікарбонатним буфером (рН 7,5). Проводять кристалізацію і висушують до залишкової вологості 10%. Одержують 100 г кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 92%. Стадія 2. 100 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 1, розчиняють в 10 л розчину, що містить 10 % ізопропілового спирту і 0,3% оцтової кислоти, та наносять на колонку діаметром 10 см, довжиною 30 см, заповнену сорбентом Діасорб-130-С16Т, 20 мкм. Елюювання проводять тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Інсулін кристалізують і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують 80 г (вихід 80%) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 95% і вмістом проінсуліну 5 ррМ. Стадія 3. 80 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 2, розчиняють в 9 л розчину, що містить 8% етанолу (або ацетонітрилу чи ізопропілового спирту) і 0,3% оцтової, кислоти. Наносять на колонку 15х30 см, залаковану сорбентом Діасорб-130-С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 годин із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 15% етанолу, 0,3% оцтової кислоти у воді (17 л), буфер Б: 50% етанолу, 0,3% оцтової кислоти у воді (17 л). Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною ВЕРХ. Після аналізу об'єднують фракції, з вмістом інсуліну не менше 98%. Одержують 72 г (вихід 90%) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 1 ррМ, дезамідованих форм - не більше 0,3%, інсуліну ВРХ - не більше 0,2%, високомолекулярних білків - не більше 0,2%. Фракції із вмістом основної речовини від 30 до 98% об'єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3. Стадія 4. 72 г високоочищеного інсуліну порціями розчинюють в 0,005-0,05 М оцтовій кислоті з доданням води для ін'єкцій (рН 3,0-3,5). Отриманий розчин інсуліну змішують поступово з розчином 10%-ного натрію хлориду, 1-2%-ного натрію оцтовокислого, 1-2%-ними розчинами цинку хлориду або окису цинку, 1-3%-ного ніпагіну або іншого консерванта, і доводять загальний об'єм суспензії до 48-53 літрів, який потім направляють на стерилізуючу фільтрацію. Простерилізовану суспензію інсуліну надалі стерильно розливають у флакони або пенфіли, інші користувачі та закупорюють їх. Потім здійснюють контроль, маркування, пакування готової продукції (препарату інсуліну пролонгованої дії). Отриманий таким чином препарат інсуліну пролонгованої дії під назвою "МК суінсулін суперлонг" має наступний склад: вміст інсуліну високоочищеного монокомпонентного (свиного або телячого або їх суміші)- 36-42 ОД (характеристика субстанції інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5-99,2 % (як правило 98,8- 99,3%), вміст проінсуліну не більше 10 ррМ (як правило, 0,01-5,0 ррМ), вміст інших баластних білків - не більше 12%), натрію хлориду- 6,5-7,5, натрію оцтовокислого- 1,25-1,45 мг, цинку хлориду- 0,05-0,10 мг або окису цинку, консерванта, наприклад ніпагіну0,9-1,4 мг, води високочищеної для ін'єкцій - до 1мл. ____________________________________________ ДП “Український інститут промислової власності” (Укрпатент) Бульв. Лесі Українки, 26, Київ, 01133, Україна (044) 254-42-30, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид.арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ Вул. Горького, 180, Київ, 03680 МСП, Україна (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3