Спосіб прогнозування розвитку дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові при гострих крововтратах

Спосіб прогнозування розвитку дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ) крові при гострих крововтратах, що включає лабораторні дослідження крові, який відрізняється тим, що в нерозбавленій сироватці або плазмі крові визначають показники прозапальних цитокінів інтерлейкіну 1β (IL-1β) і фактора некрозу пухлин-α (TNF-α) і, при збільшенні рівня IL-1β до 220,8±10,6 пкг/мл (при нормі не вище 50,0 пкг/мл), a TNF-α - до 250,5±12,6 пкг/мл (при нормі не вище 50,0 пкг/мл), прогнозують розвиток ДВЗ крові. (19) (21) u200904666 (22) 12.05.2009 (24) 11.01.2010 (46) 11.01.2010, Бюл.№ 1, 2010 р. (72) КІНАХ МАРІЯ ВАСИЛІВНА, КОНДРАЦЬКИЙ БОГДАН ОЛЕКСІЙОВИЧ, ГОЛИК ЮРІЙ ЙОСИПОВИЧ (73) КІНАХ МАРІЯ ВАСИЛІВНА, КОНДРАЦЬКИЙ БОГДАН ОЛЕКСІЙОВИЧ, ГОЛИК ЮРІЙ ЙОСИПОВИЧ 3 46751 інтерлейкіну 1 (IL-1 ) і фактору некрозу пухлин (TNF- ), і при збільшенні рівня IL-1 до 220,8 10,6пкг/мл (при нормі не вище 50,0пкг/мл), a TNF- - до 250,5 12,6пкг/мл (при нормі не вище 50,0пкг/мл) прогнозують розвиток ДВЗ крові. Цитокіни - протеїни з плейотропною активністю, яким належить важлива роль у міжклітинній комунікації та клітинній активації. Інтерлейкіни здатні як втручатися в імунну відповідь, так і впливати на систему гемостазу. Найбільший вплив на систему гемостазу має прозапальний інтерлейкін IL-1 , який діє на судинно-тромбоцитарний гемостаз, коагуляцію і фібриноліз, зокрема, активує адгезію і агрегацію тромбоцитів, а також вторинний гемостаз, провокуючи розвиток ДВЗ крові. Запропонований спосіб прогнозування розвитку ДВЗ крові при гострих крововтратах здійснюють таким чином. Для визначення IL-1 використовують твердофазний імуноферментний метод із застосуванням індикаторного ферменту - пероксидази хрону. Один тип антитіл імобілізується на внутрішніх поверхнях лунок планшетів для мікротитрування. Другий тип мононуклеарних тіл до незалежного епітопу молекули IL-1 знаходиться в наборі у ви 4 гляді кон'югата з біотином. Індикаторним компонентом є кон'югат пероксидази хрону із стрептавидином, який має високу спорідненість з біотином. Після інкубації і промивок в лунки вносять кон'югат пероксидази хрону із стрептавидином, знову інкубують, промивають, вносять субстрат і вимірюють активність зв'язаної пероксидази на автоматичному фотометрі для мікропланшетів з довжиною хвилі 450нм. Для проведення дослідження готують необхідну кількість буферних розчинів: на один подвійний стріп потрібно 75мл буферу для промивання (буфер В) і 8мл буферу для розведення взірців і концентрату (буфер С). Відбирають необхідну кількість стріпів, і потрібні лунки стріпів двічі промивають буфером В і двічі - дистильованою водою, вносячи по 300мкл в кожну лунку, з наступною повною аспірацією. Для отримання стандарту А (1200пкг/мл) розчиняють вміст ампули зі стандартним препаратом (концентратом IL-1 ) в 1мл дистильованої води (буфер С). Готують розчин стандартів IL-1 , змішуючи стандартний розчин А з буфером С (Таблиця 1). Таблиця 1 Позначення стандарту В С Д Е Концентрація IL-1 . пкг/мл 600 300 150 60 В лунки А1-Е1 і/або А2-Е2 мікропланшета вносять по 200мкл стандартів IL-1 , в лунки F1 і/або F2 вносять по 200мкл буферу С (нульова проба), в інші лунки мікропланшета вносять досліджувану плазму також по 200мкл. Всі лунки інкубують 2 години при температурі 37 С, безперервно струшуючи. Після чого видаляють рідину з лунок, тричі промиваючи їх буфером В (300мл) і двічі дистильованою водою, та проводять повну аспірацію рідини, що залишилась у лунках. Розводять 1:40 необхідну для аналізу кількість моноклональних антитіл (АТ-2) біотинованих буфером С в розрахунку 3,2мл готового розчину на 1 здвоєний стріп, добре перемішують розчин. Вносять в кожну лунку по 200мкл другого типу мононуклеарних антитіл до незалежного епітопу молекули IL-1 і інкубують при температурі 37 С протягом 30 хвилин. Після цього видаляють рідину з лунок, промиваючи їх 5 разів буфером В (300мкл на кожну лунку) і двічі дистильованою водою, та проводять повну аспірацію рідини, що залишилась в лунках. Розводять 1:40 необхідну для аналізу кількість кон'югата стрептавидину з пероксидазою хрону буфером С, вносять по 200мкл розчину в кожну лунку мікропланшета та інкубують 30 хвилин при температурі 20 2 С при безперервному струшуванні. Видаляють рідину з лунок, промиваючи їх 5 разів буфером В (300мкл на кожну лунку) і двічі дистильованою водою, та проводять повну аспірацію рідини, що залишилась в лунках. Об'єм стандарту А, мкл 100 50 25 10 Об'єм буфера С, мкл 100 150 175 190 Потім тричі промивають лунки мікропланшету струменем дистильованої води, осушують мікропланшет постукуванням по поверхні лабораторного стола, покритого фільтрувальним папером. Змішуютьу рівних кількостях розчини субстрату і реагенту, враховуючи, що на 1 здвоєний стріп потрібно 3,2мл готового розчину. Вносять у всі лунки по 200мкл розчину субстрату з барвником. Інкубують стріпи 10-20 хвилин при кімнатній температурі в захищеному від прямого сонячного світла місці і спостерігають утворення блакитного забарвлення. Зупиняють реакцію додаванням 50мкл стоп-реагенту в кожну лунку. Проводять облік результатів з використанням автоматичного, напівавтоматичного або ручного фотометра при довжині хвиль 450нм, встановлюючи нульове поглинання по лунці зі стандартом 0. Автоматичний фотометр з мікропроцесором проводить розрахунки при введенні даних калібрувальних розчинів у процесор. При використанні напівавтоматичного аналізатора вираховують значення за калібрувальною кривою - оптична густина/концентрація. Слід зауважити, що використовувати ручний аналізатор недоцільно, оскільки кількість досліджуваного матеріалу і реактивів збільшується у 4 рази. Для визначення TNF- використовують твердофазний імуноферментний метод із застосуванням індикаторного ферменту - пероксидази хрону. Один тип антитіл імобілізується на внутрішніх лун 5 46751 ках планшетів для мікротитрування. Другий тип мононуклеарних антитіл до незалежного епітопу молекули TNF- знаходиться в наборі у вигляді кон'югата з біотином. Індикаторним компонентом є кон'югат пероксидази хрону із стрептавидином, який має високу спорідненість з біотином. Після інкубації і промивок в лунки вносять кон'югат пероксидази хрону із стрептавидином, знову інкубують, промивають, вносять субстрат і вимірюють активність зв'язаної пероксидази на автоматичному фотометрі для мікропланшетів з довжиною хвилі 450нм. Дослідження проводять нерозведеними взірцями сироватки/плазми. Щоб попередити осадження фібриногену, нерозведені взірці сироватки/ 6 плазми швидко розморожують на водяній бані при температурі 37 С. Перед виконанням дослідження відбирають необхідну кількість моноклональних антитіл (АТ-2) біотинованих. Готують необхідну кількість буферних розчинів у розрахунку на 1 стріп - 50мл буферу В і 8мл буферу С Відбирають необхідну кількість стріпів з планшети. Двічі промивають буфером В, вносячи 300мкл, після чого промивають один раз дистильованою водою і проводять повну аспірацію рідини. Для отримання стандарту (1000пкг/мл) ампулу зі стандартом розводять у 1,0мл буферу С. Набір стандартів готують за схемою наведеною в таблиці 2. Таблиця 2 Позначення стандарту А В С д Е F Концентрація ФНП, пкг/мл 1000 500 250 125 50 0 В інші лунки мікропланшета вносять 200мкл досліджуваної плазми/сироватки та інкубують 1 годину при температурі 37 С. Видаляють рідину з планшета, промиваючи буфером С (300мкл) і один раз - дистильованою водою та проводять повну аспірацію рідини. Розводять 1:20 необхідну для аналізу кількість АТ-2 буфером С у розрахунку 1,6мл готового розчину на 1 стріп, добре перемішують. Піпеткою вносять по 100мкл інших антитіл, інкубують 1 годину при температурі 37 С, постійно струшуючи. Видаляють рідину з лунок, 5 разів промиваючи буфером В (300мкл) і 1 раз дистильованою водою. Проводять повну аспірацію рідини. Розводять 1:20 необхідну кількість кон'югата для аналізу. Розводять 1:20 стрептавидин із пероксидазою хрону буфером С і вносять по 100мкл розчину в кожну лунку мікропланшета. Інкубують 30 хвилин при кімнатній температурі при постійному струшуванні. Видаляють рідину з лунок, 5 разів промиваючи буфером В (300мкл) і 1 раз дистильованою водою, проводять повну аспірацію рідини. Лунки мікропланшета тричі промивають струменем дистильованої води. Осушують мікропланшет, постукуючи по столу, покритому фільтрувальним папером. Готують розчин субстрату з барвником, змішуючи у рівних кількостях субстрат і реагент, враховуючи, що на один стріп потрібно 1,6мл готового розчину. Вносять по 100мкл в кожну лунку розчину субстрату з барвником, інкубують 10-20 хвилин при кімнатній температурі, уникаючи прямого сонячного світла, і спостерігають утворення блакитного кольору. Зупиняють реакцію додаванням в кожну лунку 50мкл стоп-реагенту. Об'єм стандарту А, мкл 200 100 50 25 10 0 Об'єм буфера С, мкл 0 10 25 50 100 200 Проводять облік результатів на автоматичному, напівавтоматичному або ручному аналізаторі і розраховують за калібрувальною кривою. У випадку, якщо оптична густина перевищує величину для стандарту, досліджувану сироватку/плазму крові розводять у 10 разів. Розведення враховують при обчисленні. Для підтвердження ефективності запропонованого способу прогнозування розвитку ДВЗ крові при гострих крововтратах були проведені клініколабораторні дослідження у групах хворих з гострою крововтратою з розвитком ДВЗ (8 хворих) і без розвитку ДВЗ (12 хворих) в період кровотечі і через добу після її зупинки та в контрольній групі (10 здорових людей-донорів). Стан системи гемостазу для діагностики ДВЗ оцінювали за показниками: кількість тромбоцитів, час згортання за Лі-Уайтом, кількість фібриногену за методом Р.А. Рутберг (1962), тромбіновий час (ТЧ) за методом Сірмаі (1964), активований частковий тромбопластиновий час (АЧТЧ) наборами реактивів „Технология Стандарт", активність анти тромбіну III (AT III), ретракція кров'яного згустку (РКЗ) і спонтанний лізис (СЛ) за методом Е.П. Іванова (1977), паракоагуляційні тести (етаноловий і протамін-сульфатний) за методом Ліпінскі (1952), орто-фенантроліновий тест наборами реактивів „Технология Стандарт", розчинні комплекси мономерів фібрину (РКМФ) продукти деградації фібрину/фібриногену стафілококовим клампінг-тестом наборами реактивів „Simko". Результати клініколабораторних досліджень представлені у таблиці 3. 7 46751 8 Таблиця 3 Показники прозапального інтерлейкіну IL-1 і TNF- у хворих з крововтратами № п/п 1. 2. Показники, од. вимір. IL-1 , пкг/мл TNF- , пкг/мл Контроль (n=10) 42,0 5,40 40,0 5,40 Без ДВЗ (n=12) З ДВЗ (n=8) 58,4 6,5 53,2 6,3 318,6 16,5 Р 0,001 323,6 21,3 Р 0,001 Примітка: Р - достовірність у порівнянні з контролем. При повторному дослідженні через добу у 8 хворих зміни гемостазіологічних показників вказували на розвиток ДВЗ: у 7 хворих - І фази, в 1 хворого - II фази. У І фазі час згортання крові скоротився до 264,5 24,6с (при контролі - 486,8 14,8с), ТЧ - до 13,1 0,3с (при контролі -15,3 0,4с), РФ - до 2,6 0,3г/л (при контролі - 3,6 0,2г/л), АЧТЧ - до 28,4 2,2с (при контролі - 3,6 3,2с). У І фазі розвитку ДВЗ було зафіксовано появу ПДФ і РКМФ до 9,6 1,2 (при контролі - 0), підвищення ортофенантролінового тесту - до 6,2 0,4 (при контролі 2,1 0,2мкг/мл), зниження активності AT III 68,4 2,8 (при контролі - 98,8 8,6 ), пригнічення фізіологічного лізису - до 6,4 0,7 (при контролі 14,5 1,2 ). Рівень IL-1 підвищувався, у порівнянні з первинним дослідженням з 328,6 16,5пкг/мл до 346,5 14,4пкг/мл, TNF- - з 363,6 21,3 до 410,8 16,4пкг/мл (Р 0,05). У групі хворих, гемостазіологічні показники яких не вказували на розвиток ДВЗ, рівень IL-1 через добу становив 76,8 4,9пкг/мл, TNF- - 80,5 6,2пкг/мл. Клінічний приклад 1. Хворий М., 36 років, поступив в хірургічне відділення ургентно з виразковою хворобою, ускладненою шлунково-кишковою кровотечею. Об'єктивні дані: артеріальний тиск 110/60мм рт.ст. блідість шкірних покривів. Під час фіброезофагогастроскопії - тромб на виразці. Результати лабораторних досліджень: загальний аналіз крові: ШОЕ - 18мм/год, гемоглобін 78г/л, лейкоцити - 5,8Г/л, еритроцити - 2,2Т/л, лейкоформула: е-4 ; п-3 ; с-72 ; м-7 ; л-16 , гематокрит-23 . Біохімічні дослідження: загальний білок - 64,4г/л, IL-1 - 46пкг/мл, TNF- - 49пкг/мл. Гемостазіограма: КТ - 224Г/л, Лі Уайта 5хв.,48 с, АЧТЧ - 30с, ПДФ і РКМФ - 4, ортофенантроліновий тест 2,4мкг/мл, етанолова проба від'ємна, активність АТ-ІП 78 , підвищена ретракція кров'яного згустку до 72,4 . Через добу зміни гемостазіологічних показників підтримувались на рівні помірної гіперкоагуляції. IL-1 становив 53пкг/мл (при нормі до 50пкг/мл), TNF- 56пкг/мл (при нормі до 50пкг/мл). Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Коливання рівня IL-1 та TNF- в межах норми засвідчили сприятливий прогноз нормалізації гемостазу при гострих крововтратах. Клінічний приклад 2. Хворий К., 42 роки., поступив у травматологічне відділення з політравмою, в т.ч. черепномозкова травма, розрив печінки. Об'єктивні дані: хворий непритомний, шкірні покриви бліді, покритий холодним потом, артеріальний тиск - 110/60мм рт.ст.; Результати лабораторних досліджень: загальний аналіз крові - ШОЕ-21мм/год, гемоглобін 84г/л, лейкоцити - 5,8Г/л, еритроцити- 1,98Т/л, лейкоформула - е-3 ; п-4 ; с-70 ; м-8 ; л-10 , гематокрит-18 . Біохімічні дослідження: загальний білок - 61,8г/л, сечовина сироватки крові 2,2ммоль/л (норма - 2,5-8,8ммоль/л), креатинін сироватки крові - 67мкмоль/л (норма - 4497мкмоль/л), загальний білірубін - 38,2мкмоль/л, прямий - 31,4мкмоль/л, непрямий - 6,8мкмоль/л, IL-1 - 282пкг/мл, TNF- - 289пкг/мл. Гемостазіограма: КТ - 214Г/л, Лі Уайта 4хв., 35с, АЧТЧ-31с, ПДФ і РКМФ - 4, ортофенантроліновий тест 2,6мкг/мл, етанолова проба від'ємна, активність АТ-ІІІ 72 , підвищена ретракція кров'яного згустку до 76,4 (60-70 ), фізіологічний лізис -24,2 (норма - 10-20 ). Через добу зміни гемостазіологічних показників вказували на ДВЗ гіперкоагуляційну фазу: Лі Уайта 4хв., 05с, АЧТЧ - 26с, ТЧ - 12с, ПДФ і РКМФ - 8мкг/мл, позитивні етанолова і протамінсульфатна проби,активність AT III - 68 , о - фенантроліновий тест - 10,6мкг/мл, РКЗ - 5,8 , фізіологічний лізис -78 , IL-1 - 323пкг/мл, TNF-α 248пкг/мл. Підвищення IL-1 та TNF- вказувало на активацію процесу згортання, тромбінемію та розвитку ДВЗ крові. Запропонований спосіб прогнозування розвитку дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові при гострих крововтратах дозволяє передбачити розвиток ДВЗ ще до появи тромбінемії і зробити відповідну корекцію. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601