Спосіб моделювання реактивного хронічного запалення яєчників

Спосіб моделювання запалення, що включає внутрішньочеревинне введення дрібним тваринам λ-карагінену в розчині хлориду натрію, який відрізняється тим, що реактивне хронічне запалення яєчників відтворюють на мишах шляхом введення λ-карагінену в проекції яєчників. (19) (21) u200910222 (22) 08.10.2009 (24) 25.02.2010 (46) 25.02.2010, Бюл.№ 4, 2010 р. (72) ГРИЩЕНКО МИКОЛА ГРИГОРОВИЧ, КЛИМЕНКО МИКОЛА ОЛЕКСІЙОВИЧ, ТАТАРКО СЕРГІЙ ВІКТОРОВИЧ 3 ампулярний кінець труби поблизу фімбрій підводять кетгутову лігатуру і перев'язують трубу в зазначеному відділі, другий кінець цієї ж лігатури проводять на відстані 0,2см від місця перев'язки труби, але не перев'язують. Стінку труби проколюють тонкою ін'єкційною голкою, яку потім просувають на 2см проксимально і вводять зі шприца 0,2мл добові культури золотавого стафілокока (штам 209). Після витягу голки вище місця проколу виконують перев'язку труби, попередньо накладеною лігатурою. Друга труба служить контролем. Черевну порожнину ушивають наглухо. Відомий також спосіб моделювання асептичного хронічного запалення придатків матки [Тихоновская О. А. Моделирование острого и хронического воспаления придатков матки // Молодежь и научно-технический прогресс. - Тез. докл. - Томск, 1986. - с.76.]. В якості експериментальних тварин були обрані безпородні білі щури-самки масою 200-220г. Під інгаляційним масочним наркозом парами ефіру виконують лапаротомію, рога матки виводять і обкладають стерильними серветками. Тонкою ін'єкційною голкою проколюють матковий ріг у безпосередній близькості від яйцепроводу і просувають голку дистальніше. За допомогою інсулінового шприца по обидва боки в ріг матки в безпосередній близькості від яйцепроводу й в область яєчникової сумки вводять по 0,1мл 0,5% розчину карагеніну, що складається з комплексу фракцій сульфатированої галактози, виділеної з морських водоростей. Відомий спосіб моделювання запальних захворювань жіночих статевих органів [Пат. №2142163 С1, RU, МПК: G09B23/28, Старкова Е.В., Дергачева Т.Н., Асташов В.В. Способ моделирования воспалительных заболеваний женских половых органов. Опубл. 27.11.1999]. Для моделювання використовують білих безпородних щурів. Здійснюють введення Staphylococcus aureus у дозі 3106 мікробних тіл. Введення виконують у задньобокову стінку середньої третини піхви туберкуліновим шприцом під слизову оболонку. Спосіб дозволяє створити модель з найбільш повним наближенням до клінічного плину патологічного процесу у жінок. Відомий спосіб моделювання хронічного запалення придатків матки шляхом проведення у білих безпородних статевозрілих щурів-самок нижньосерединної лапаротомії [Пат. №2224297 С1, RU, МПК: G09B23/28, Тихоновская О.А., Невоструев С.А., Логвинов СВ. Способ моделирования хронического воспаления придатков матки. Опубл. 20.02.2004]. Лапаротомний розріз виконують довжиною 1,5-2см, вводять добову культуру золотавого стафілокока, штам 209 у дозі 0,1мл, що містить 50млн мікробних тіл, безпосередньо в яйцепроводи, одномоментно десерозують у 8-10 точках вісцеральну очеревину яйцепроводів і покривний епітелій яєчників медичним скарифікатором, після чого розпорошують над десерозированими ділян2 ками медичний тальк у дозі 0,1мг/см , операційну рану пошарово ушивають окремими кетгутовими швами, тварин виводять з експерименту на 30-40у добу шляхом декапітації під інгаляційним наркозом парами ефіру. Дана корисна модель спрямо 47934 4 ваний на наближення експериментальної моделі до клінічного і морфологічного плину хронічного запалення придатків матки у жінок. Крім того, відомий спосіб моделювання запальних захворювань верхніх відділів жіночих статевих органів [Пат. №2279142 С1, RU, МПК: G09B23/28, Горяева Н.А., Беда Ю.В., Пермякова А.Н. и др. Способ моделирования воспалительных заболеваний верхних отделов женских половых органов. Опубл. 27.06.2006]. Білим безпородним щурам-самкам вводять у парацервікальну клітковину в області перешийка матки під наркозом флогогенні агенти - Staphylococcus aureus і/чи Escherichia coli у дозі 3106 мікробних тіл. Відомий також спосіб моделювання запалення шляхом внутрішньочеревинного введення щурам 5 мг λ-карагінену ("Sigma", США) в 1мл 0,9% розчину хлориду натрію (Клименко Н.А. Роль лейкоцитов в реакции тучных клеток очага воспаления // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1993. - Т.116, №9. - с.249-253). Модель сприяє одержанню достовірної картини запального процесу. Даний спосіб моделювання запалення є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. Недоліком способу-прототипу є те, що внутрішньочеревинне введення не дозволяє в повній мірі відтворити клінічний перебіг патологічного процесу статевих органів у жінок. Крім того, модель використовує в якості лабораторних тварин щурів, у той час як більш кращою моделлю для відтворення в наступному процесів, що супроводжують ексракорпоральне запліднення, є миші. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення ефективності моделювання реактивного хронічного запалення яєчників. Задачу, яку покладено в основу корисної моделі, вирішують тим, що у відомому способі моделювання запалення, що включає внутрішньочеревинне введення дрібним тваринам λ-карагінену в розчині хлориду натрію, згідно з корисною моделлю, реактивне хронічне запалення яєчників відтворюють на мишах шляхом введення λ-карагінену в проекції яєчників. Технічний ефект корисної моделі, а саме підвищення ефективності моделювання реактивного хронічного запалення яєчників, обумовлений тим, що для моделі використовують мишей, які є загальновизнаним інструментом тестування якості лабораторного устаткування і середовищ культивування, які застосовуються у лабораторіях ДРТ (Quinn P, Horstman FC. Is the mouse a good model for the human with respect to the development of the preimplantation embryo in vitro? // Hum Reprod. 1998. - Vol.13 (4). - P.173-183.). Крім того, внутрішньочеревинне введення λ-карагінену в проекції яєчників дозволяє створити модель з найбільш повним наближенням до клінічного плину хронічного запалення яєчників у жінок. Ефективність моделі доведена експериментально. 5 Досліди поставлені на 42 мишах-самках лінії BALB/c масою 18-20г. Тваринам внутрішньоочеревинно в проекції яєчників вводили 1мг λ-карагінену ("Sigma", США) у 0,5мл ізотонічного розчину хлориду натрію. У виведених з експерименту тварин забирали яєчники з прилеглими пасмами сальника. Отриманий матеріал фіксували в 10% водяному розчині нейтрального формаліну. По закінченні спиртової проводки матеріал піддавали парафіновій проводці, після чого виготовляли серійні зрізи товщиною -6 4-5×10 м. Оглядові препарати, пофарбовані гематоксиліном і еозином, використовували для загальної оцінки стану досліджуваних тканин і морфометричного дослідження. Фарбування препаратів фукселеном на еластичні волокна за Вейгертом з дофарбовуванням пікрофусином за методом Ван Гізон використовували для виявлення і диференціювання сполучнотканинних структур. Гістологічні методики виконували по прописах, викладених у посібниках з гістологічної техніки і гістохімії [Микроскопическая техника: руководство / Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544с]. Вивчення мікропрепаратів проводили на мікроскопі "Olympus" BX-41 (Японія) з наступним мікроскопічним фотографуванням. Кількісну морфометричну оцінку клітинного складу запального інфільтрату проводили за допомогою комп'ютерного цитоаналізатора "Olympus", окуляра-мікрометра АМ9-2. При збільшенні ×400 на поверхню зображення гістологічних препаратів накладали сітку, що має рівновіддалені точки (у нашому дослідженні використовувалася сітка Автанділова із 100 точок) і виконували диференційований підрахунок точок, що приходяться на ту чи іншу клітинну форму. Визначали кількість різних клітинних елементів запального інфільтрату: фібробластів (Фб), фіброцитів (Фц), макрофагів 47934 6 (М), лімфоцитів (Л), еозинофілів (Е), нейтрофільних гранулоцитів (НГ), плазматичних клітин (П), епітеліоїдних клітин (Еп). Перед забоєм тварин із хвостової вени одержували периферичну кров і визначали загальну кількість лейкоцитів (ЗКЛ) у крові і лейкоцитарну формулу стандартними методами [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. 368с]. Результати досліджень обробляли методом варіаційної статистики на персональному комп'ютері з використанням стандартних програм кореляційного аналізу, з обчисленням середніх арифметичних величин: М, м, σ за допомогою електронних таблиць "Ехеl-5". Було встановлено, що в динаміці запалення, викликаного внутрішньочеревинним введенням карагінену, відбуваються помітні реактивні запальні зміни на поверхні яєчників, у товщі тканини яєчників і в навколишніх тканинах яєчника. У першу добу розвертається нейтрофільна фаза запалення, а, починаючи з 3-ї доби, вона змінюється нейтрофільно-макрофагальною фазою. Тривалість фази ексудації невелика, розлади мікрогемоциркуляції і нейтрофільної інфільтрації нетривалі і помірковано виражені. З 7-ї доби і до 28-ї доби на тлі прогресуючого зменшення нейтрофільних гранулоцитів збільшується кількість макрофагів, лімфоцитів і плазмоцитів. Починаючи з 14 доби і до завершення експерименту, має місце формування хронічного продуктивного запалення, як у білочній оболонці, поверхневих відділах коркового шару яєчника, так і в прилеглому сальнику. На 28 добу визначається слабко виражений склероз білочної оболонки, що підтверджується збільшенням кількості фіброцитів у складі клітинних кооперацій (табл.1). Таблиця 1 Клітинний склад вогнища хронічного запалення в яєчниках (М±m, n=6) Строки досФб Фц М Л Е НГ П Еп лідження Контроль 7,2±0,63 43,05±0,39 14,15±0,41 14,45±0,29 4,75±0,64 12,7±0,53 2,3±0,36 1,25±0,21 1 доба 7±0,34 16,1±0,48*** 26,9±0,64*** 9,15±0,53*** 2,9±0,43* 36,05±0,58*** 1,05±0,36* 1,6±0,28 3 доба 1,2±0,36*** 5,05±0,39*** 23,05±0,44*** 10±0,43*** 3,1±0,33* 58,2±0,36*** 0 0 7 доба 4,15±0,41** 10,95±0,42*** 45,1±0,4*** 11,9±0,4*** 1,15±0,38*** 25,95±0,44*** 1,35±0,38 0 14 доба 3,95±0,42** 15,85±0,55*** 32,8±0,42*** 26,05±0,42*** 3,05±0,42 11,85±0,4 3,65±0,4* 3,05±0,39** 21 доба 4,95±0,39* 10,85±0,41*** 28,95±0,44*** 34,65±0,31*** 1,1±0,37*** 14,8±0,33** 5±0,4*** 0 28 доба 4,95±0,39* 14,85±0,35*** 26,95±0,39*** 34±0,37*** 5,1±0,37 7,05±0,42*** 7,1±0,37*** 0 Примітка: * - р≤0,05; ** - р≤0,01; *** - р≤0,001 достовірна відмінність від контроля (інтактні миші). У периферичній крові ЗКЛ трохи збільшується на 1-у добу запалення і вірогідно - на 7-у-28-у добу із двома максимумами - на 14-у і 28-у добу. При цьому вміст сегментоядерних нейтрофілів вірогідно збільшується на 1-у-14-у добу з максимумом на 14-у, а паличкоядерних - на 3-ю і 7-у добу. Зростає також кількість еозинофілів (на 21-у добу). Кількість моноцитів підвищена з 1-ї по 28-у добу з піком на 28-у. Вміст лімфоцитів після деякого зниження на 1-y-3-ю добу потім відновлюється і фазфазно збільшується - на 14-у і 28-у добу (табл. 2). Таблиця 2 7 47934 8 9 Лейкоцити периферичної крові (×10 /л) мишей в динаміці хронічного карагіненового запалення (M±m, n=6) Строки дослідження Контроль 1 доба 3 доба 7 доба 14 доба 21 доба 28 доба Нейтрофіли Л Моноцити паличкоядерні сегментоядерніе 2,73±0,25 0,028±0,009 0,042±0,016 0,236±0,03 2,279±0,249 0,148±0,02 3,325±0,41 0,04±0,013 0,056±0,019 0,58±0,10** 2,316±0,319 0,334±0,056** 2,89±0,26 0,048±0,012 0,115±0,029* 0,673±0,092*** 1,69±0,215 0,366±0,058** 4,12±0,23** 0,043±0,012 0,134±0,029* 0,678±0,077*** 2,932±0,216 0,411±0,027*** 5,12±0,64** 0,0515±0,018 0,096±0,025 0,863±0,196** 3,661±0,478* 0,429±0,061** 3,94±0,32* 0,092±0,015** 0,077±0,026 0,327±0,049 2,696±0,274 0,765±0,077*** 5,10±0,48*** 0,049±0,012 0,091±0,025 0,464±0,12 3,625±0,355** 1,039±0,148*** ЗКЛ Е Примітка: * - р≤0,05; ** - р≤0,01; *** - р≤0,001 достовірна відмінність від контроля (інтактні миші). Комп’ютерна верстка О. Рябко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601