Вакцина інактивована рекомбінантна проти інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби

Вакцина шактивована рекомбінантна проти інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби, що містить мікроорганізм, який має антигени, ідентичні вірусу ІРТ, яка відрізняється тим, що як вірус використовують рекомбінантний штам Bacillus alvei-413, при цьому вакцинний матеріал вирощують на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням (1 %) глюкози та (5 %) сироватки крові коней Винахід, що передбачається відноситься до ветеринари, а саме до профілактичної імунізації великої рогатої худоби (ВРХ) проти інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) Незважаючи на велику КІЛЬКІСТЬ засобів специфічної профілактики (живої та шактивовані вакцини, пперімунні сироватки), герпесвірус-1 ВРХ збудник інфекційного ринотрахеїту, продовжує займати одне з ведучих міст в етіології пневмоентеритів молодняку ВРХ Цей факт може бути обумовленим перше - можливістю вірусу інфекційного ринотрахеїту довгий час персистувати в організмі вакцинованих тварин, що дає можливість виникнення рекомбінантних варіантів при взаємозв'язку атенуйованого та вірулентного штамів вірусу, а це може привести до реверсибельності атенуйованих штамів, в других здатністю вірусу ІРТ індуцировати супресію імуної ВІДПОВІДІ, що в умовах вакцинації не дозволяє досягти ефективної поствакцинальної імуної Є вакцина "БИВАК" проти ІРТ та парагрипу (АС № 1092778 от 17 12 82, кл А61К 39/12), яка в якості вірусу ІРТ має штам Herpes virus bovis 1 MBA/1/80N15 Для удосконалення специфічної імунопрофілактики ІРТ доцільно використовувати імуні препарати, що мають протективні антигени вірусу ІРТ ВРХ, але не впливають негативно на імунокомпетентну систему макроорганізму В основу винаходу, що передбачається поставлено задачу розробити вакцину шактивовану рекомбінантну проти інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби Задача вирішується шляхом виготовлення вакцини з культури Bacillus alvei-413, в геном якої природно інтегрований вірус інфекційного ринотрахеїту ВРХ, при цьому вакцинний матеріал вирощують на м'ясопептонному бульйоні (МПБ) з додаванням (1%) глюкози та (5%) сироватки крові коней Вакцина являє собою бактеріальну шактивовану суміш з концентрацією бактеріальних клітин 10млрд/см3 Аналіз технічних рішень, які ВІДОМІ В галузі біотехнологм специфічних ветеринарних препаратів дозволяє зробити висновок про відсутність ознак, що схожі з суттєвими ВІДМІННИМИ ознаками до вакцини, що заявляється, та признати це рішення, ВІДПОВІДНИМ критерію "суттєві ознаки" Вакцину виготовляють таким чином Одержують виробничу партію культури Bacillus alvei-413 Для цього роблять її висів над полум'ям пальника в м'ясопептонний бульйон з додаванням 1% глюкози та 5% сироватки крові коней ВІДПОВІДІ Для удосконалення специфічної імунопрофілактики ІРТ доцільно використовувати імуні препарати, що мають протективні антигени вірусу ІРТ ВРХ, але не впливають негативно на імунокомпетентну систему макроорганізму Існує вакцина проти інфекційного ринотрахеїту ВРХ (А С № 926813 от 17 04 81 кл А61К 39/12), яка має вірус інфекційного ринотрахеїту штам Bovine "ТК-А(ВИЭВ) В-2" Недоліком цієї вакцини є те, що її використання обмежується тільки господарствами відгодівельного типу О ю 49450 У пробірку з матровою розплідною Bacillus alvei-413 над полум'ям пальника вносять Зсм3 стерильно фізіологічного розчину з рН-7,2 та обережно струшують Змив бактерій з агару відбирають стерильною піпеткою та вносять у МПБ Після ЦЬОГО флакони з посівами Bacillus alvei-413 розмішують у термостаті Концентрацію мікробних тіл в 1см3 одержаної суспензії Bacillus alvei-413 визначають за допомогою стандарту каламутності Одержану суспензію концентрують центрифугуванням з подальшим відбором надосаду Після інактивації у суспензію додають розчин алюмокалієвого галуну до кінцевої концентрації 1% Випробування специфічної вакцини здійснюють у КІЛЬКОСТІ реакції аглютинації з пперімунними сироватками ВРХ Вакцина придатна, якщо виготовлений з неї антиген ІРТ в реакції кількісної аглютинації позитивно реагує з гомологічною пперімунною сироваткою ВРХ в титрі 1 64 та вище Приклад 1 Визначення стерильності Визначення наявності контамінації бактеріальною і грибковою мікрофлорою проводили у ВІДПОВІДНОСТІ до ГОСТ 28085-89 "Препарати біологічні Методи бактеріологічного контролю стерильності на МПА, МПБ, МППБ та живильному середовищі" Посіви на МЛА, МПБ витримуали при 37 - 38°С 10 діб, на МППБ - 15 днів, на живильному середовищі при температурі 20 - 22°С 10 діб Вакцина не була контамшована флорою Стерильність серії вакцини характеризує ступінь інактивації Приклад 2 Визначення нешкідливості Використовували 3флакони з вакциною, їх об'єднали у одному стерильному флаконі, струшували і потім використовували Вакцину вводили 10 білим мишам масою 18 - 20г підшкірно по 0,2см3 Вакцина не викликала захворювання і загибель мишей за 10 діб спостереження Приклад 3 Визначення реактогенності Використовували 5 флаконів з вакциною Готували загальну пробу вакцини Реактогенність визначали в ДОСЛІДІ на 2 телятах віком 1 - 2 МІСЯЦІ або 5 кролях вагою 2,5 - Зкг Телятам вводили вакцину підшкірно в ДІЛЯНЦІ середньої третини шиї у дозі 10см3 (концентрація мікробних тіл 10млрд/см3) Після введення вакцини за тваринами спостерігали 10 діб з щоденною термометрією Вакцина не викликала КЛІНІЧНИХ ознак захворювання у телят Допускається підвищення температури тіла тварин на 0,5°С на 1 - 2 доби і незначне виділення з носа серозного ексудату Приклад 4 Визначення імуногенності Кролям (5 голів) вакцину з концентрацією мікробних тіл 10млрд/см3 вводили підшкірно в ДІЛЯНЦІ середньої третини шиї у дозі 0,5см3 Щеплених тварин через 4 доби ревакцинували у дозі 1см3 аналогічним методом За тваринами вели КЛІНІЧНІ спостереження впродовж всього випробування Серологічний контроль проводили через 7 - 1 0 діб після останнього введення вакцини методом кількісної реакції аглютинації (РА) Результати серологічних досліджень (в КІЛЬКІСНІЙ РА) телят після пероральної та штраназальної вакцинації "Вакциною шактивованою рекомбінантною проти ІРТ великої рогатої худоби" або сироваткою крові тваринреконвалесцнтів наведені в таблиці 1 З матеріалів таблиці видно, що після щеплення дослідних тварин шактивованою вакциною та сироваткою реконвалесцентів титри антитіл до вірусу ІРТ досягали рівня 1 32 -1 64, що свідчить про імунізуючу дію препаратів Імуногенну активність вакцини характеризує поява у сироватках крові кролів специфічних до вірусу інфекційного ринотрахеїту ВРХ антитіл на рівні 3 - 5 Іодг та вище Кожну п'яту серію вакцини випробували на імуногенну активність, використовуючи 4 телят, у сироватці крові яких немає специфічних антитіл на діагностичному рівні до вірусу ІРТ великої рогатої худоби Наявність антитіл у сироватці крові кролів та телят визначали у реакції кількісної аглютинації з антигеном з „Набору антигену й сироваток для діагностики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби", ТУУ 46 15 229-97 Двох телят серонегативних до вірусу ІРТ ВРХ щеплили дворазове з інтервалом у 21 добу вакциною в дозі 10см3 (концентрація мікробних тіл 10млрд/см3) підшкірне в ДІЛЯНЦІ середньої третини шиї, а 2 залишають як контрольних Через 7 - 1 0 діб після закінчення щеплення відбирали сироватки крові від щеплених (2 голови) і контрольних (2 голови) телят У телят щепленої групи титр специфічних антитіл до вірусу ІРТ ВРХ повинен мати рівень 5 7 Іодг при відсутності його у контрольних Приклад 5 Результати досліджень трансформаційної активності мононуклеарів та їх функціональних характеристик наведено в таблиці 2 З матеріалів таблиці видно, що при пероральному щепленні шактивованою рекомбінантною вакциною телят до випойки молозива відзначали и стимулюючий вплив на трансформаційну активність мононуклеарних клітин та підвищення їх функціональних характеристик Показник макрофагальної трансформації мононуклеарів крові (ПМТМ) збільшився з 20,8 ± 1,2% до 2,8 ± 1,1%, фагоцитарна активність зросла з 28,7 ± 0,9% до 36,3 ± 1,5%, а фагоцитарне число зросла з 3,3 ± 0,2 до 4,9 ±0,3 У дослідних телят 2 групи, яких пасивно імунізували сироваткою реконвалесцентів, ПМТМ та фагоцитарне число достовірно не відрізнялись від контролю, але спостерігали підвищення фагоцитарної активності З наведених матеріалів витікає, що при пероральному та штраназальному введенні шактивованої рекомбшантної вакцини проти ІРТ великої рогатої худоби, спостерігається підвищення ПМТМ та фагоцитарної активності, що свідчить про імуномоделюючу дію препарату Таким чином, запропонована схема перорального та штраназального введення 49450 шактивованої рекомбінантної вакцини забезпечує специфічну активацію системного і місцевого імунітету проти ІРТ Вибір шляхів введення обумовлений тим, що воротами інфекції при ІРТ великої рогатої худоби є слизові оболонки шлунково-кишкового та респіраторного тракту Приклад 6 Результати порівняльного вивчення імунізуючої активності й специфічності імунітету при введенні вакцини живої проти ГРТ "IPT-LG" та вакцини шактивованої рекомбінантної проти ІРТ великої рогатої худоби з штаму Bacsllus alvei № 413 в дослідах на телятах 6 - 7 місячного віку наведені в таблиці 3 Контролем були не щеплені тварини Вакцина, що виготовлена з використання штаму Bacillus alvei-413, дозволяє профілактувати ІРТ ВРХ Вакцина високоімуногенна, що підкріплює її перспективність та економічну ефективність Ця вакцина знайде застосування у неблагополучних по ІРТ господарствах, що дозволить запобігти розповсюдження цього захворювання та значно знизити економічні витрати тваринництва від нього Таблиця 1 №№ п/п до введення вакцини 1 2 3 4 5 6 1 64 18 1 32 1 32 18 18 1 2 3 18 18 14 після введення вакцини ДОСЛІДНІ тварини 1 групи* 1 64 1 64 1 64 1 64 1 32 1 32 ДОСЛІДНІ тварини 2 групи** 1 64 1 64 1 32 Примітка * - тваринам першої групи до випійки молозива "per os" та штраназально вводили вакцину "Вакцину шактивовану рекомбінантну проти ІРТ великої рогатої худоби", ** - тваринам другої групи до випійки молозива "per os" та штраназально вводили сироватку крові тварин-рконвалесцентів Таблиця 2 Показники макрофагальної трансформації мононуклеарних клітин та їх функціональної активності після вакцинації №№ п/п 1 2 3 4 5 6 М ±т 1 2 3 М ±т Показник монуклеарної Фагоцитарна активність, % Фагоцитарне число трансформації мононуклеарів (ПМТМ), % до щеплення після щеплення до щеплення після щеплення до щеплення після щеплення 1 дослідна група 23 25 зо 39 3,8 4,0 21 зо 26 36 3,7 4,8 19 27 27 41 2,9 5,9 20 26 28 35 3,4 5,1 17 28 32 37 3,1 4,3 25 32 29 ЗО 3,0 5,4 20,0 ±1,2 28 ±1,06 28,7 ±0,9 36,3 ±1,54 3,3 ±0,2 4,9 ±0,3 2 дослідна група 18 20 31 29 2,9 3,0 23 25 25 27 4,1 3,2 19 17 28 31 3,7 3,5 20+1,5 20,7 ±2,3 28,0+1,7 3,6 ±0,4 3,2 ±0,1 29 ± 1,15 49450 Таблиця З Результати вивчення імунізуючої активності та специфічності імунітету при введенні вакцини живої проти ІРТ "IPT-LG" та вакцини шактивованої рекомбінантної проти ІРТ великої рогатої худоби Титр специфічних антитіл до вірусу ІРТ через 7 через 14 через 21 через 7 через 17 через 24 через ЗО До тварин щеплення ДНІВ ДНІВ день ДНІВ ДНІВ дня ДНІВ 1 116 1 126* 1 512* 1 256 отр 1 1024 1 1024 1 64 2 1 32 1 256 1 512 1 1024 1 32 1 128 1 256 3 1 16 1 256 1 512 1 256 1 64 1 128 1 256 1 32 4 1 128 1 256 1 1024 1 1024 отр 1 64 1 256 1 64 5 1 128 1 512 1 1024 1 1024 1 256 1 256 1 256 1 32 Введення 6 1 128 1 512 1 256 1 128 1 16 1 128 1 256 1 32 штаму 7 1 32 1 512 1 1024 1 1024 "IPT-LG" отр 1 512 1 512 1 16 8 1 32 1 512 1 2048 1 4096 1 1024 1 2048 1 2048 1 1024 9 18 1 256 1 256 1 512 отр 1 256 1 256 10 1 16 1 256 1 256 1 512 отр 1 256 1 256 11 1 128 1 1024 1 2048 1 1024 отр 1 256 1 256 1 32 5,2 8,5 9,5 9,3 4,1 8,2 8,5 5,8 12 1 16 1 128 1 1 32 1 32 13 1 16 1 16 1 1 16 1 32 14 1 32 1 16 1 1 16 1 64 Контроль 15 1 128 1 32 1 1 16 1 64 16 1 64 1 16 1 1 16 1 16 5,2 4,8 4,2 5,2 17 1 128 1 256* 1 512* 1 512* 1 256 1 512 18 1 16 1 1024 1 2048 1 1024 Введення 1 128 1 512 Bacillus 19 1 32 1 256 1 512 1 512 1 1024 1 256 alvei 20 1 64 1 512 1 1024 1 512 1 512 1 512 21 1 16 1 256 1 512 1 512 1 1024 1 256 Примітка * - штраназальне введення Bacillus alvei 413 доза 2,0см, концентрація 10млрд мікртел/см КІЛЬКІСТЬ ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71