Спосіб визначення групи ризику розвитку цукрового діабету 2 типу

Спосіб визначення групи ризику розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів, який відрізняється тим, що для слов'ян України як маркер використовують однонуклеотидний поліморфізм Q192R гена PON-1 і в разі наявності гомозиготного генотипу роблять висновок про підвищений ризик виникнення цукрового діабету 2 типу. (19) (21) u200911392 (22) 09.11.2009 (24) 25.06.2010 (46) 25.06.2010, Бюл.№ 12, 2010 р. (72) КАРАЧЕНЦЕВ ЮРІЙ ІВАНОВИЧ, ГОРШУНСЬКА МАР'ЯНА ЮРІЇВНА, АТРАМЕНТОВА ЛЮБОВ ОЛЕКСІЇВНА, ПОЛТОРАК ВІКТОРІЯ ВІТАЛІЇВНА, ТИЖНЕНКО ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА, ПОЧЕРНЯЄВ АРТЕМ КОСТЯНТИНОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ІМ. В.Я. ДАНИ 3 50681 пошуку генетичних маркерів захворювань із спадковим компонентом, в тому числі і цукрового діабету, пов'язане з тим, що в них зазвичай мають на увазі людину взагалі, а не представника визначеної етнічної групи, члена конкретної популяції, що еволюціонувала в унікальних клімато-географічних умовах. Задача корисної моделі: розробка способу визначення групи ризику відносно розвитку цукрового діабету серед слов'ян України. Поставлена задача вирішується тим, що при визначенні групи ризику розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів, для слов'ян України в якості маркера використовують однонуклеотидний поліморфізм Q192R гену PON1 і в разі наявності гомозиготного генотипу роблять висновок про підвищений ризик виникнення цукрового діабету 2 типу. Технічний результат - розширення переліку маркерів ризику розвитку цукрового діабету етноспецифічних для слов'ян України, що дозволить підвищити точність діагностики цього захворювання в даній популяції. Однонуклеотидний поліморфізм гену PON-1, що призводить до зміни активності параоксонази, є несинонімічною заміною Q192R SNP в Region Ex6+78A>G [8]. Ця заміна пов’язана із продукцією двох ізоферментів, що розрізняються амінокислотними залишками – глютаміновим (Q) або аргініновим (R) - в позиції 192 активного центру фермента [16]. Заявлений спосіб реалізується таким чином. У особи, що досліджується, забирають 10мл венозної крові. ДНК виділяється з лейкоцитів за допомо 4 гою іонообмінної смоли Челекс-100 (ChelexR100) [15]. Однонуклеотидну заміну, яка призводить до зміни в амінокислотній послідовності параоксонази у позиції 192 з глютаміну на аргінін, визначають шляхом ампліфікації в полімеразній ланцюговій реакції фрагмента гену розміром 199 пар нуклеотидів з наступним гідролізом ендонуклеазою BspPI. Використовують прямий (PON192F TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG) і зворотний (PON192R GACATACTTGCCATCGGGTGAA) праймери [12]. В якості маркера молекулярної маси використовують ДНК pUC19, гидролізовану ендонуклеазою MspI. Розділення фрагментів ДНК після рестрикції проводять за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гелі. Генотип особи, що досліджується за геном PON-1 визначають за електрофореграмою ПЛР-продуктів (Фіг.1). Одна смужка, що відповідає фрагменту ДНК розміром 199 пар нуклеотидів (зразки 1-4, 6 і 9) вказує на генотип QQ. Дві смужки, що вказують на фрагменти ДНК довжиною 135 і 64 пари нуклеотидів (зразок 8) вказують на генотип RR. Три смужки ДНК розміром 199, 135 и 64 пари нуклеотидів (зразки 5 і 7) вказують на генотип QR. За нашими даними, частоти алелей гена PON1 значуще не відрізняються у чоловіків і жінок, а також у росіян і в українців [4], а також у хворих на цукровий діабет 2 типу і здорових людей [3]. Розбіжності між хворими і здоровими стосуються розподілу генотипів: у хворих на цукровий діабет 2 типу спостерігається надлишок обох гомозигот QQ і RR, і нестача гетерозигот QR (табл. 1). Таблиця 1 Частоти генотипів за однонуклеотидним поліморфізмом гена у хворих на цукровий діабет 2 типу і здорових людей Група Здорові Цукровий діабет 2 типу На підставі цих даних одержані показники відносного ризику. Для індивіда з генотипом QQ ймовірність захворіти на цукровий діабет 2 типу в 1,46 рази перевищує середнє популяційне значення, для індивіда з генотипом RR ризик підвищений в QQ 39,02±4,42 57,29±5,08 Генотип, % QR 52,03±4,52 26,04±4,50 RR 8,94±2,58 16,67±3,82 1,86 разів. Гетерозиготніть за поліморфізмом Q192R PON1 є фактором антиризику щодо розвитку цукрового діабету 2 типу - ймовірність захворювання для індивіда з генотипом QR в два рази менша, ніж в середньому в популяції (табл. 2). Таблиця 2 Оцінка ризику захворювання на цукровий діабет 2 типу в залежності від генотипу за однонуклеотидним поліморфізмом Чинник Відносний ризик 95% довірчий інтервал Спосіб було апробовано в клініці ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського» АМН України на 96 хворих на цукровий діабет 2 типу. QQ 1,46±0,14 1,18-1,74 Генотип, % QR 0,50±0,19 0,12-0,88 RR 1,86±0,37 1,13-2,60 Для оцінки ризику розвитку цукрового діабету 2 типу підраховували показник відношення шансів OR [6] за допомогою чотирьохпільної таблиці. Якщо клітини таблиці позначити а (хворий з наявніс 5 50681 тю даного генотипу), b (хворий без даного генотипу), с (здоровий з даним генотипом), d (здоровий, що не має даного генотипу), то відношення шансів дорівнює: OR=ad/bc. Для знаходження статистичної похибки показника OR використовували логарифмічну шкалу. Для цього находили натуральний логарифм OR (lnOR), а його статистичну похибку slnOR розраховували за формулою: 6 slnOR=√(1/a+1/b+1/c+1/d). Статистичну похибку slnOR використовували для знаходження довірчого інтервалу (ДІ) логарифма відношення шансів ln OR: ДІ: lnOR±tslnOR де t - критерій Стьюдента (для 95% ДI t=2). Потім за допомогою операції експонування знаходили довірчий інтервал для OR. 95% ДІ OR: exp(lnOR-tslnOR)÷exp(lnOR+tslnOR) Отримані дані наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Відношення шансів для різних генотипів Генотип RR QQ QQ.RR QR а 16 55 71 25 Вихідні дані b с 80 11 41 48 25 59 71 64 D 112 75 64 59 Як свідчать дані табл. 3, генотип RR збільшує шанс захворіти на цукровий діабет 2 типу в два рази, а генотип QQ - в 2,1 рази. Гомозиготність за вивченим поліморфізмом збільшує, а гетерозиготність (QR) зменшує ймовірність захворіти на цукровий діабет в три рази. Таким чином розроблений спосіб дозволяє підвищити точність визначення ризику розвитку ЦД серед слов'ян України. Література: 1. Бочков Н.П. Клиническая генетика. [Текст] /Н.П. Бочков. - М.: Издательский дом «ГЭОТАРМЕД», 2004. - 480с. 2. Гинтер Е.К. Медицинская генетика [Текст] / Е.К. Гинтер. - М.: Медицина, 2003. - 448с. 3. Полиморфизм Q192R гена PON-1 у больных сахарным диабетом 2 типа [Текст] / М.Ю. Горшунская, Ю.И. Караченцев, Л.А. Атраментова [и др.] // Цитология и генетика, (в печати). 4. Полиморфизм гена параоксоназы (PON-1) у славянской части населения Харькова [Текст] /А.К. Почерняев, Т.В. Тыжненко, М.Ю. Горшунска [и др.] // Цитология и генетика. - 2009. - Т.43. - №5. - С.6468. 5. The Gln-Arg 191 polymorphism of the human paraoxonase gene (HUMPONA) is not associated with the risk of coronary artery disease in Finns [Text] /M. Antikainen, S. Murtomaki, M. Syvanne [et al.] // J. Clin. Invest. - 1996. - Vol.98. - P.883-885. 6. Armitage P. Statistical methods in medical research [Text] / P. Armitage, G. Berry - 3rd ed. Blackwell Scientific Publications, 1994. - 620p. 7. Human serum paraoxonase gene polymorphism, Q192R and L55M, are not associated with the risk of cerebral infarction in Chinese Han population [Text] / Q. Huang, Y.H. Lui, Q.D. Yang [et al.] //Neurol. Res. - 2006. - Vol.28 (5). - P.549-554. 8. GenBank is the NIH genetic sequence database, an annotated collection of all publicly available DNA sequences [Electronic resource]. Режим доступу: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov. OR lnOR slnOR 95 ДІ OR 2,04 2,10 3,08 0,32 0,71 0,74 1,12 -1,14 0,42 0,28 0,29 0,29 0,89-4,71 1,20-3,67 1,74-5,41 0,18-0,57 9. Serum paraoxonase activity and its relationship to diabetes complication in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus [Text] /Y. Ikeda, T. Suchiro, M. Inoue [et al.] // Metabolism. 1998. - Vol.47., N5. - P.598-602. 10. Paraoxonase-l (PON1) activity, but not PON1 (Q192R) phenotype, is a predictor of coronary artery disease in a middle-ages Serbian population [Text] / J. Kotur-Stevuljevic, S. Spasic, A. Stefanovic [et al.] // Clin. Chem. Lab. Med. - 2006. - Vol.44 (10). - P.12061213. 11. Odawara M, Tachi Y, Yamashitya K. Paraoxonase polymorphism (Gin 192-Arg) is associated with coronary heart disease in Japanese noninsulin-dependent diabetes mellitus [Text] / M. Odawara, Y. Tach, K. Yamashitya // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1997. - Vol.82. - P.2257-2260. 12. Gln-Argl92 polymorphism of human paraoxonase gene is not associated with coronary artery disease in Italian patients [Text] / D. Ombres, G. Pannitteri, A. Montali [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 1998. - Vol.18. - P.1611-1616. 13. Paraoxonase phenotype distribution in a healthy Iranian population [Text] F. Sepahvand, M. Shafiei, S. Ghaffari [et al.] // Basic Clin Pharmacol Toxicol. - 2007. - Vol.101 (2). - P.104-107. 14. Paraoxonase 192 Gln-Arg polymorphism an independent risk factor for nonfatal arterial ischemic stroke among young adults [Text] / B. Voetsch, M. Kelly, S. Benke [et al.] // Stroke. - 2002. - Vol.33. P.1459-1464. 15. Walsh, P.S. Chelex 100 as a medium for extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material [Text] / P.S. Walsh, D.A. Metzger, R. Higuchi // BioTechniques. - 1991. - №10. - P.506-513. 16. Paraoxonase (Pon1) Q192R polymorphism and serum PON1 activity in diabetic patients on maintenance hemodialysis [Text] / B. Zhang, S. Eto, P. Fan [et al.] // Clin. Nephrol. - 2003. - Vol.60(4). P.257-265. 7 Комп’ютерна верстка О. Рябко 50681 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601