Спосіб діагностики целіакії-спру

Спосіб діагностики целіакм-спру, що включає виявлення специфічних антитіл до глютену та енДОМІЗІЮ в сироватці крові пацієнта з використову ванням тест-об'єктів у вигляді крюстатних зрізів пшеничного зерна і стінки шлунка білого лабораторного щура, який відрізняється тим, що тестоб'єкти монтують попарно в єдиний слайдпрепарат, на який наносять сироватку крові досліджуваного хворого і у випадках одночасного імунозабарвлення оболонок крохмальних зерен пшеничного зерна і міжклітинної субстанції гладком'язевої тканини стінки шлунка діагностують целіакію-спру Спосіб, який заявляється, належить до області медицини і може бути використаний для диференціальної діагностики целіакм-спру (ЦС) ЦС - це ентеропатія, обумовлена патогенним впливом на слизову оболонку тонкої кишки глютену (білка клейковини злакових рослин) Частота виявлення захворювання серед дорослого населення різних країн коливається від 1 300 до 1 8000 осіб, а серед близьких родичів хворих на ЦС - від 10% до 23% випадків [1, 2] Захворювання починається звичайно в дитячому ВІЦІ і може протікати в гострій формі або розвиватися поступово, довгий час не проявляючись КЛІНІЧНО Для розгорнутої клінічної картини характерна тріада мальабсорбція, атрофія ворсинок слизової оболонки верхніх ВІДДІЛІВ тонкої кишки і непереносимість глютену [2, 3] Основними морфологічними ознаками ЦС є укорочення кишкових ворсинок (атрофія парціальна, субтотальна або тотальна) і сплощення покриваючих їх ентероцитів, подовшання крипт і зростання в них числа МІТОЗІВ, зменшення відношення висоти ворсинок до глибини крипт, збільшення КІЛЬКОСТІ міжепітеліальних лімфоцитів (МЕЛ) і підвищення їх мітотичного індексу (більше 0,2%), посилення лімфоплазмоцитарної інфільтрації особистої пластинки слизової оболонки [2, 4] Виходячи з особливостей гістологічної картини слизової оболонки тонкої кишки, розрізняють два типи ЦС При першому типі кишкові ворсинки мають нормальні параметри, але відрізняються високим вмістом малих МЕЛ, які не поділяються Крипти мають звичайну будову або ппертрофовані При другому типі відзначається атрофія ворсинок і гіперплазія крипт Епітелій містить велику КІЛЬКІСТЬ МЕЛ, серед яких зустрічаються лімфобласти і лімфоцити які поділяються [3] Тривалий перебіг захворювання та недотримання аглютенової дієти призводять до тяжких порушень харчування, аж до розвитку кахексії, і здатні до розвитку гастроштестинальних карцином [3] ЗЛОЯКІСНІ пухлини діагностуються у 1 - 14% хворих на ЦС [2] Точне раннє розпізнавання ЦС і негайне призначення хворим строгої довічної аглютенової дієти значно покращують якість життя пацієнтів, роблять більш сприятливим прогноз хвороби і різко знижують ризик розвитку злоякісних новоутворень В зв'язку з цим удосконалення методів виявлення даного захворювання слід вважати актуальним завданням клінічної медицини Для діагностики ЦС використовуються як інвазивні (біопсія), так і нешвазивні методи дослідження Останні грунтуються на виявленні в сироватці крові хворих на ЦС антитіл до глютену або аутоантитіл до ендомізію (ретикуліноподібної міжклітинної субстанції гладкої мускулатури) Підвищення специфічності і чутливості нешвазивних способів діагностики роблять ентеробюпсію необов'язковою Існує спосіб нешвазивної діагностики ЦС, який дозволяє виявити циркулюючі в крові антитіла до глютену з допомогою непрямої реакції імунофлуоресценцм Джерелом антигену в даному методі є О ^ о ю 52040 крюстатні зрізи набухлого пшеничного зерна, на які наносять спочатку сироватку крові досліджуваного хворого, а потім - мічені флуорохромом антитіла проти імуноглобулінів людини На користь ЦС свідчить виразна яскрава імунофлуоресценція тканини пшеничного зерна [5] Однак, недоліком способу слід вважати складність Інтерпретації результатів імуноморфолопчних реакцій, пов'язану з можливою варіабельністю картин свічення структур пшеничного зерна (оболонок крохмальних зерен і/або септ) В іншому способі діагностики ЦС, заснованому на непрямій реакції імунофлуоресценцм, джерелом антигену служать крюстатні зрізи стінки стравоходу, фіксовані на предметному склі Як і в вищевказаному способі, тест-об'єкт шкубують з сироваткою крові досліджуваного хворого, після чого на зрізи наносять мічену флуорохромом антисироватку проти імуноглобулінів крові людини ЦС діагностується при наявності імунофлуоресценцм ендомізію [6, 7, 8] Недоліком способу є можливість помилкового висновку у випадках імунофлуоресценцм ретикуліну, який огортає клітини гладкої мускулатури Прототипом заявлюваного способу діагностики ЦС послужив спосіб, розроблений К Sjolerg з співавторами, який дозволяє встановити діагноз ЦС на основі виявлення в сироватці крові хворого обох відомих типів антитіл, специфічних для ЦС [9, 10] Спосіб авторів здійснюється таким чином 1 Специфічні для ЦС антитіла до глютену розпізнаються з допомогою твердофазного імуноферментного методу 2 Специфічні для ЦС антиендомізіальні аутоантитіла застосовуються з допомогою непрямої реакції імунофлуоресценцм, яка ставиться на крюстатних зрізах стінки стравоходу 3 Діагноз ЦС установлюється на основі виявлення обох типів специфічних антитіл Недоліком цього способу є те, що для виявлення двох типів антитіл треба виконувати два різних методи, що ускладнює хід проведення діагностичних досліджень і потребує придбання дефіцитних реактивів і коштовної техніки В основу способу діагностики ЦС, який заявляється, було поставлене завдання розробити такий спосіб діагностики, який спрощує проведення досліджень, гарантує високу специфічність результатів, підвищує надійність і точність діагностики, виключає обов'язковість забору ентеробюпсій і зменшує матеріальні витрати, необхідні для його проведення Поставлене завдання вирішується шляхом одночасної постановки непрямої реакції імунофлуоресценцм на зрізах набухлого пшеничного зерна - джерела глютену і на зрізах стінки шлунка білого лабораторного щура - джерела ендомізію гладкої мускулатури Використання зрізів двох тест-об'єктів в одному препараті дозволяє одночасно виявляти два типи антитіл, специфічних для ЦС, що спрощує процедуру діагностики, виключає можливість діагностичних помилок і скорочує матеріальні витрати При співставленні способу діагностики, який заявляється, з методом-прототипом виявлені загальні ознаки - проводять ідентифікацію 2-х типів специфічних для ЦС антитіл (антитіл до глютену і аутоантитіл до ендомізію), - для виявлення антиендомізіальних аутоантитіл застосовують відомий метод непрямої реакції імунофлуоресценцм ВІДМІТНИМИ ознаками способу діагностики, який заявляється, від методу-прототипу є - крюстатні зрізи набухлого пшеничного зерна - джерела глютену і крюстатні зрізи стінки шлунка білого лабораторного щура - джерела ендомізію монтують попарно в єдиний слайд-препарат на гістологічному предметному склі, - виявлення двох типів специфічних для ЦС антитіл проводять одночасно з допомогою єдиного методу досліджування - методу непрямої реакції імунофлуоресценцм Відзначена сукупність відомих і ВІДМІТНИХ ознак, які характеризують спосіб, у ВІДОМІЙ техніці не виявлена Суть способу не випливає з відомого рівня техніки Таким чином, спосіб, який заявляється відповідає критеріям патентоспроможності, новизни та винахідницького рівня Спосіб промислово виконуваний і може бути використаний в практичній охороні здоров'я Спосіб діагностики, який заявляється, здійснюється таким чином 1 На гістологічне предметне скло попарно, поряд один з одним, розміщують крюстатні зрізи набухлого пшеничного зерна і стінки шлунка білого лабораторного щура (на одному склі - 3 - 4 пари зрізів) 2 Зрізи просушують при кімнатній температурі на протязі 2-х годин 3 На парні тест-об'єкти наносять сироватку крові досліджуваного хворого в послідовних розведеннях 1 5,1 10,1 20 4 Інкубацію зрізів з сироваткою крові хворого проводять у вологій камері, при кімнатній температурі, на протязі однієї години 5 Після споліскування в дистильованій воді зрізи відмивають в трьох порціях забуференого фізіологічного розчину (ЗФР) на протязі 15 хвилин 6 Надлишок ЗФР видаляють і на тест-об'єкти наносять антитіла проти імуноглобулінів крові людини, мічені флуорохромом 7 Інкубацію зрізів з міченими антитілами і наступне відмивання в ЗФР здійснюють ВІДПОВІДНО до прописів представлених в пп 4 і 5 8 На зрізи наносять ЗОмкл забуференого гліцерину (1 частина гліцерину і 3 частини ЗФР) 9 Результати дослідження оцінюють з допомогою люмінесцентного мікроскопа ЦС діагностують у випадках одночасної імунофлуоресценцм глютену оболонок крохмальних зерен пшеничного зерна і ендомізію гладком'язової тканини стінки шлунка Для постановки контрольної реакції використовують сироватки крові донорів, які не містять циркулюючих антитіл Даний спосіб діагностики целіакм-спру ілюструється прикладами Приклад 1 Хворий Д , 43 роки Поступив в клініку інституту гастроентерології 24 10 1984 р КЛІНІЧНИЙ діагноз Захворювання тонкої кишки? Целіакія-спру? Рахує себе хворим 10 років Скарги 52040 втрата маси тіла на 13кг за останні 3 МІСЯЦІ, ПОНОС, випорожнення 3 - 7 раз на добу При гістологічному дослідженні бюптату тонкої кишки виявлені субтотальна атрофія кишкових ворсинок, гіперплазія кишкових крипт, виражена лімфоцитарна інфільтрація кишкового епітелию з появою бластних форм міжепітеліальних лімфоцитів При електронномікроскопічному дослідженні лімфобласти виявлені не тільки в епітелії атрофованих ворсинок, але і у власній пластинці слизової оболонки тонкої кишки При імунопстохімічному дослідженні в сироватці крові, розведеної в 10 і 20 разів виявлені антитіла до оболонок крохмальних зерен набухлого пшеничного зерна і ендомізія гладкої мускулатури стінки шлунка білого лабораторного щура На основі КЛІНІЧНИХ даних, а також результатів морфологічних і імунопстохімічних досліджень був підтверджений діагноз целіакм-спру Приклад 2 Хвора М , ЗО років Поступила в клініку інституту гастроентерології 15 111991 р КЛІНІЧНИЙ діагноз Целіакія-спру? Хворіє з дитинства Скарги втрата маси тіла на 20кг на протязі 6 МІСЯЦІВ, понос, випорожнення 5 раз на добу При гістологічному дослідженні бюптату тонкої кишки виявлена субтотальна атрофія кишкових ворсинок, різко виражена лімфоцитарна інфільтрація слизової оболонки, поява міжепітеліальних лімфобластів При імунопстохімічному дослідженні в сироватці крові, розбавленої в 20 разів, виявлені антитіла до оболонок крохмальних зерен набухлого пшеничного зерна, ендомізію гладкої мускулатури і паріетальних клітин шлунка На основі даних КЛІНІКИ і результатів морфологічних та імунопстохімічних досліджень встановлено діагноз Целіакіяспру Аутоімунний гастрит Спосіб діагностики ЦС, який заявляється, використаний в лабораторії патоморфології інституту гастроентерології АМН України і в центрі імунопсТОХІМІЧНОІ діагностики при обстеженні 24-х дорослих пацієнтів з підозрою на ЦС В результаті проведених імунопстохімічних досліджень діагноз ЦС підтверджений у 14 хворих (10 жінок і 4 ЧОЛОВІКІВ) У 3 жінок розвиток ЦС був спровокований вагітністю У 8 хворих перші ознаки захворювання з'явилися в дитинстві В усіх випадках відзначена поєднана циркуляція в крові антитіл до глютену і аутоантитіл до ендомізію У 5 хворих одночасно виявлені аутоантитіла до парієтальних клітин шлунка, а у 1 хворого - антиретикулінові аутоантитіла, що свідчило про супутні аутоімунний гастрит та герпетиморфний дерматит При морфологічному вивченні ентеробюптатів виявлена атрофія кишкових ворсинок (частіше субтотальна), гіперплазія кишкових крипт, потужна активація місцевої імунної системи зі збільшенням КІЛЬКОСТІ бластних форм серед міжепітеліальних і стромальних лімфоцитів Застосування техніки напівтонких зрізів і електронної мікроскопи виявило сплощення щіткової обвідки, деформацію та зменшення числа мікроворсинок, послаблення абсорбційної функції ентероцитів, поява на кишкових ворсинках незрілих епітеліальних клітин, що вважається характерним для ЦС Це свідчить на користь надійності і точності нешвазивної діагностики ЦС при використанні способу, який заявляється, и необов'язкового проведення швазивного підтвердження захворювання У 10 обстежених осіб діагноз ЦС не підтвердився У 7 з цих хворих був встановлений хронічний гастрит з секреторною недостатністю (в 4 випадках аутоімунної природи), у 2 хворих - хронічний ентероколіт, у 1 хворого - хвороба Крона У всіх спостереженнях відзначені КЛІНІЧНІ прояви хронічного дуоденіту або хронічного єюніту, але специфічні для ЦС антитіла в сироватці крові не виявлені Це дозволяє рекомендувати використання способу, який заявляється, для диференціальної діагностики мальабсорбцм, обумовленої хронічним гастритом з секреторною недостатністю, хронічним ентероколітом, хворобою Крона або глютенчутливою ентеропатією Таким чином, спосіб, який заявляється, ВІДПОВІДНО якого джерела глютену та ендомізію монтують попарно в єдиний слайд-препарат і обробляють сироваткою крові пацієнта одночасно, з допомогою непрямої реакції імунофлуоресценцм, дозволяє одночасно виявляти два типи специфічних для ЦС антитіл (до глютену і ендомізію) Це спрощує проведення діагностичних досліджень, забезпечує високу точність діагностики ЦС, робить необов'язковим проведення ентеробюпсм, а також виключає необхідність придбання дефіцитних реактивів і коштовної техніки, що робить нешвазивну діагностику ЦС більш доступною для практичної охорони здоров'я Література 1 Парфенов А И Глютеновая энтеропатия Целиакия взрослых // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии — 1997 — № 3 — С 22-24 2 Аруин Л И , Капуллер Л Л , Исаков В А Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника — М Триада-Х, 1998 —484с 3 Гайдар Ю А , Пругло Ю В , Канищев П А Морфологическая семиотика синдрома целиакииспру // Архив патологии — 1984 — Т 46, № 4 — с 86 - 93 4 Oberhuber G , Vogelsang H , Stobte M et al Evidence that intestinal mtraepithehal lymphocytes are activated cytotoxic T-cells in celiac disease but not in giardiasis // Am J Pathol — 1996 — V 148 — P1351 -1357 5 Гайдар Ю A, Ващенко Р Г Экспрессдиагностика синдрома целиакии-спру // Архив патологии — 1989 — Т51, №10 — С 55-58 6 Kumar V , Lerner A Valencky J E et al Endomysial antibodies in the diagnosis of celiac disease and the effect of gluten on antibody titers // Immunol Investig —1989 — V18, №1 -4 — P 533-544 7 DiskeyW, McMillan S A , Hughes D F Identification of coehac disease in primary care // Scand J Gastroenterol — 1998 — V 33, № 5 — P 491 493 8 Atrmkson К , Tokmakajian S , Watson W et al Evalution of the endomysial antibody for coehac disease operating properties and associated cost implications in clinical practice // Can J Gastroenterol — 1997 — V 11, №8 — P 673-677 9 Sjolerg R , Eriksson К F , Bredbery A et al Screening for celiac disease in adult insulindependent diabetes // J Intern Med — 1998 — V243, № 2 — P 133-140 7 52040 10 Sjolerg К, Lmdgren S , Enkson K F Endomysial but not ghadm antibodies predict coehac disease in patients with chronic liver disease // Scand J Gastroenterol — 1997 — V 12, № 11 — P 1162 1167 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71