Спосіб прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри у хронічне запалення

Спосіб прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри в хронічне за палення шляхом аналізу функціональної активності клітин крові, який відрізняється тим, що досліджують стимульовану активність НАДФНоксидази моноцитів до і через 3-5 днів лікування, причому в контрольну пробу із суспензією моноцитів додають АТФ, а в дослідну - додатково вводять форбол мірістату ацетат, і якщо процентна різниця активності НАДФН-оксидази моноцитів між контрольною і дослідною пробами при повторному дослідженні змінюється менше, ніж на 15 % у порівнянні з вихідною, прогнозують перехід гострого запалення в хронічне Спосіб, що заявляється, відноситься до галузі медицини, зокрема, до клініко-лабораторних досліджень і може бути використаний для оцінки можливості хронізаци запального процесу Відомим Є спосіб прогнозування гнійних ускладнень гострого запалення внутрішніх органів у посттравматичному періоді [Масютин В А, Широков Д М Способ прогнозирования гнойных осложнений в посттравматическом периоде - Авторское свидетельство RU 95119291-МПК G01 N33/48 Оп 1998 06 10] шляхом аналізу лейкоцитарної формули, обраний в якості аналогу При цьому на третю добу після травми чи оперативного утручання визначають КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів у мазку крові і розраховують коефіцієнт адаптації При значенні коефіцієнта > 0,8 прогнозують сприятливий перебіг посттравматичного (післяопераційного) періоду, при значенні коефіцієнта в діапазоні 0,1 - 0,79 - можливість розвитку гнійних ускладнень і при його значенні < 0,1 прогнозують розвиток гнійних ускладнень і несприятливий результат ницкая Т Е , Витковский Ю А Роль цитокинов в регуляции реакций иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности у родильниц с послеродовыми эндометритами - Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов - 1998 - №1 - С 22 - 25] шляхом аналізу вмісту в крові регуляторів функціональної активності клітин крові, обраний в якості прототипу При цьому визначають вміст ЦИТОКІНІВ (штерлейкінів - ІЛ-1а, ІЛ-1р, ІЛ-8, фактора некрозу пухлин ФНО), показників гемостазу (час зсідання крові, час рекальцифікацм плазми, протромбіновий час, активований частковий тромбопластиновий час, концентрацію фібриногену, рівень антитромбіну III, вміст тромбоцитів), неспецифічної резистентності організму (НСТтест, лізосомально-катюнний тест) і при посиленні продукції запальних ЦИТОКІНІВ, кисневозалежних і кисневонезалежних функцій нейтрофілів, розвитку комплексу гемокоагуляційних порушень прогнозують розвиток післяпологового ендометриту Недоліки відомого способу полягають у низькій інформативності запропонованого показника, який не дозволяє проаналізувати саногенетичні і патогенетичні механізми регуляції функціональної активності клітин крові, що реалізують запальний процес в органах Найбільш близьким за технічною сутністю до способу, що заявляється, є спосіб прогнозування гнійно-септичних ускладнень у породіль [Белокри Недоліки способу полягають у тому, що, поперше, пропонують використовувати велику КІЛЬКІСТЬ біохімічних показників, інформативність яких відносно до прогнозу результату гострих запальних захворювань внутрішніх органів жіночої полової системи не визначена, причому для проведення таких біохімічних досліджень потрібно від 6 до 12 годин, по-друге, не аналізуються внутрішньоклітинні сигнальні механізми, які реалізують і підтри 1 00 о ю 54087 мують запалення, що знижує точність прогнозу По-третє, для досліджень in vitro обрані нейтрофіли, що беруть участь на початку гострої фази запалення, тоді як результат запалення визначається функціональною активністю інших клітин моноцитів, і, як наслідок, знижується точність способу Таким чином, відомий спосіб не дозволяє швидко і, головне, точно, оцінити механізми регуляції запалення, а отже, прогнозувати результат гострих запальних захворювань внутрішніх органів і шкіри Так, за нашими даними, імовірність прогнозу гнійно-септичних ускладнень гострих запальних захворювань внутрішніх органів жіночої полової системи за описаним вище способом не перевищує 60% В основу винаходу покладена задача створення способу прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри в хронічне, у якому забезпечується точна експрес-діагностика можливої хронізаци запалення шляхом кількісної оцінки внутрішньоклітинних механізмів моноцитів, що регулюють розвиток, підтримують і завершують запалення, що дає можливість оптимізувати лікувальну тактику і скоротити терміни лікування хворих з гострими запальними захворюваннями внутрішніх органів і шкіри Поставлена задача вирішується таким чином, що в способі прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри в хронічне, ВІДПОВІДНО до винаходу, досліджують стимульовану активність НАДФН-оксидази моноцитів до- і через 3 - 5 днів лікування, причому в контрольну пробу із суспензією моноцитів додають АТФ, а в дослідну - додатково вводять форбол мірістату ацетат, і якщо процентна різниця активності НАДФН-оксидази моноцитів між контрольною і дослідною пробами при повторному дослідженні змінюється менш, чим на 15% у порівнянні з вихідною, прогнозують перехід гострого запалення в хронічне Новим у способі, що заявляється, є те, що досліджують стимульовану активність НАДФНоксидази моноцитів до-1 через 3 - 5 днів лікування, причому в контрольну пробу із суспензією моноцитів додають АТФ, а в дослідну - додатково вводять форбол мірістату ацетат, і якщо процентна різниця активності НАДФН-оксидази моноцитів між контрольною і дослідною пробами при повторному дослідженні змінюється менш, ніж на 15% у порівнянні з вихідною, прогнозують перехід гострого запалення в хронічне Розробка способу, що заявляється, стала можливою завдяки наступним науковим фактам Поперше, у хворих з гострими запальними захворюваннями внутрішніх органів (обстежено 10 хворих з післяпологовим ендометритом, 8 - 3 гострим гнійним сальпінгоофоритом) і шкіри (12 пацієнтів з гострою екземою) на клітинах крові виявлено різний ступінь зниження хемосенситивності (десенситизація) рецепторів, що ІНІЦІЮЮТЬ запалення шляхом підвищення змісту внутрішньоклітинного Са 2+ Дослідження проводилося in vitro на суспензії моноцитів, виділених за стандартною методикою з крові хворих до- і через 3 - 5 доби після початку лікування У якості агоністів Рги-рецепторів КЛІТИН застосовували АТФ у дозах (100 - ЗООмкМ) У кон трольній групі (здорові особи) ЕС50 (ефективна концентрація АТФ, що підвищує активність НАДФН-оксидази in vitro на 50%) складала 120,2 ± 10,5мкМ До лікування виявили зниження хемосенситивності Рги-рецепторів, відображенням чого було збільшення ЕС5о АТФ до 207,6 ± 11,5мкМ (зростала на 72,7% у порівнянні з контролем) Через 3 - 5 днів після лікування, ґрунтуючись на величині ефекту, що реєстрували, обстежених пацієнтів можна було розподілити на дві групи У 1-й групі (п = 18) ЕС5о для АТФ досягала 143,1 ± 11,1мкМ (знижувалася на 31,1% у порівнянні з даним показником до лікування, р 0,1) Подальші дослідження виявили розвиток хронічного запалення ендометриту, хронічного сальпінгоофориту і хронічної екземи Таким чином, під час переходу гострого запалення в хронічне зберігається десенситизація (зниження чутливості) Рги-рецепторів, що викликають активацію моноцитів По-друге, при розвитку хронічного запалення в моноцитах визначено збереження високої активності протешкінази С - ключового ферменту внутрішньоклітинного сигнального шляху, що модулює функцію клітин крові Об'єктивним критерієм процесу внутрішньоклітинної модуляції є зміна активності НАДФН-оксидази (ферменту, що реалізує «респіраторний вибух» у фагоцитах, якими є моноцити, і, ВІДПОВІДНО, відбиває ступінь функціональної активності моноцитів) В 1-Й групі ECso для форболу мірістату ацетату, що є прямим стимулятором протешкінази С склала 17,5 ± 1,5нг/мл, ВІДПОВІДНО на 64,5% менше у порівнянні з даним показником до лікування Для порівняння в 2-й групі після лікування ECso форболу мірістату ацетату досягала 33,3 ± 2,4нг/мл, що на 34% менше в порівнянні з даним показником до лікування По-третє, морфометричне дослідження бюпсійного матеріалу (слизова оболонка матки, яйцеводів і тканини яєчника, а також шкіри) підтвердило наявність зворотного зв'язку між активністю НАДФН-оксидази і удільною площею клітинних інфільтратів у пстопрепараті Причому в 1-й групі де, як уже підкреслювалося, через 3 - 5 днів після початку консервативного лікування мали місце відновлення хемосенситивності Рги-рецепторів, що ІНІЦІЮЮТЬ активацію моноцитів, і зниження активності протешкінази С, ключового ферменту внутрішньоклітинного сигнального шляху, що модулює функціональну активність моноцитів Наслідком зазначених змін було підвищення активності НАДФН-оксидази більш, ніж на 15% Приведені факти, по суті, відбивають відновлення високої функціональної активності моноцитів, підтвердженням цього є виявлене нами зменшення удільної площі клітинних інфільтратів у бюптатах слизової оболонки матки, яйцеводу і стромі яєчника на 50 - 70% (р 0,05) у порівнянні зі значеннями показника до лікування Викладене вище підтверджує, що десенситизація Рги-рецепторів і збереження високої активності протешкінази С в моноцитах через 3 - 5 днів після початку лікування є причинами їх низької функціональної активності (відображенням чого є активність НАДФН-оксидази) За цих умов оцінка «полому» регуляторного впливу моноцитів на функції клітин, що приймають участь у запаленні, дозволяє точно прогнозувати результат (видужання чи хронізацію) гострого запалення у внутрішніх органах і шкірі Технічна простота запропонованого способу забезпечує багаторазове дослідження динаміки гострого запалення у внутрішніх органах і шкірі Досягнення технічного результату даного способу засновано на дослідженні стимульованої активності НАДФН-оксидази моноцитів до-1 через 3 5 днів лікування, причому в контрольну пробу із суспензією моноцитів додають АТФ, а в дослідну додатково вводять форбол мірістату ацетат, і якщо процентна різниця активності НАДФН-оксидази моноцитів між контрольною і дослідною пробами при повторному дослідженні змінюється менш, ніж на 15% у порівнянні з вихідною, прогнозують перехід гострого запалення в хронічне Наші результати показали, що якщо прогноз переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри в хронічне запалення формулювати на основі дослідження стимульованої активності НАДФН-оксидази моноцитів до- і через 3 - 5 днів лікування і змінами и процентної різниці між контрольною і дослідною пробами при повторному дослідженні у порівнянні з вихідною, то точність збігу результатів отриманих in vitro із КЛІНІКОморфолопчними даними обстеження пацієнтів підвищується до 85% Реалізують спосіб таким чином, Моноцити виділяли зі свіжої вилученої периферичної крові шляхом осідання еритроцитів за допомогою декстрану Т-500 («Loba-Chemie») і наступним фракціонуванням плазми на FicoH-Paque Еритроцити, що залишилися, видаляли дворазовим ЛІЗІСОМ 0,2%-ним розчином NaCI Клітини ДВІЧІ відмивали центрифугуванням у розчині Хенкса (рН 7,4) без фенолового червоного КІЛЬКІСТЬ життєздатних моноцитів у суспензії, що визначали в тесті з 0,1% розчином трипанового синього, складала 95 - 98% Виміри проводили в суспензії, що містила 1 106 клітин у і мл За ЗОхв до початку інкубації до моноцитів додавали Са 2+ і Мд2+ до концентрацій 1,8 і 1,0мкМ ВІДПОВІДНО У контрольну пробу в якості агоністу Рги-рецепторів до 1мл суспензії МОНОЦИТІВ додавали 100 - ЗООмкМ АТФ, 2мМ азиду натрію, 0,4% тритону Х-100 і НАДФН у концентраціях від 0,05 до 0,4мМ У дослідну пробу додатково вводили форболу мірістату ацетат 10 50нг/мл Стандартний зразок об'ємом 1мл містив 50мкМ цитохрому С і 1 106 клітин у розчині Хенкса без фенолового червоного Інкубацію здійснювали при 37°С 7 - 15хв Активність НАДФНоксидази визначали за чутливим до супероксид дисмутази відновленням цитохрому С, вимірюючи оптичну ЩІЛЬНІСТЬ при 550нм на спектрофотометрі СФ-46 Приводимо конкретні приклади реалізації способу прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри, що заявляється Приклад 1 У пацієнтки Ч 15-ти років (історія хвороби №15518) діагностовано гострий післяопераційний ендометрит і гострий оофорит 3 метою прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів жіночої полової системи в хронічне до лікування проведено дослідження суспензії моноцитів, що виділили з периферичної крові за стандартною методикою Отриману суспензію моноцитів розділили на 2 проби У контрольну пробу в якості агоністу Рги-рецепторів додавали АТФ, шкубували протягом Юхв і спектрофотометричне визначали активність НАДФН-оксидази При концентрації АТФ 200мкМ активність НАДФНоксидази in vitro склала 0,46нмоль Ог + /хв/106 клітин, що на 42,5% менше, ніж у групі здорових жінок і може бути свідоцтвом зниження хемосенситивності Рги-рецепторів У ДОСЛІДНІЙ пробі після додавання в інкубаційний розчин форболу мірістату ацетату в концентрації 25нг/мл активність НАДФН-оксидази in vitro досягала 0,62 О-А - /хв/106 клітин Процентна різниця змін активності НАДФНоксидази між дослідною і контрольною пробами склала 34,8% Через 3 - 5 днів після призначення протизапальної терапії (комбінована антибактеріальна терапія ампіциліном із сульбактамом, гентаміцином і кліндаміцином, метронідазол, корекція дизпротешемм та ппоосмолярного стану) активність НАДФН-оксидази в контрольній пробі склала 0,47нмоль ПРОг + /хв/106 клітин, а в дослідної 0,70нмоль Ог + /хв/106 клітин Різниця змін активності НАДФН-оксидази між дослідною і контрольною пробами склала 48,9% Оскільки процентна різниця змін активності НАДФН-оксидази моноцитів у контрольній і ДОСЛІДНІЙ пробах після лікування складає 14,1% (менше 15%) у порівнянні зі значеннями до лікування, то прогнозували перехід гострого ендометриту і оофориту в хронічні Об'єктивним підтвердженням прогнозу служили результати морфологічного дослідження бюптатів ендометрія через 5 днів після лікування і повторно - через 3 МІСЯЦІ Виявлено зменшення удільної площі клітинних інфільтратів у стромі ендометрія ВІДПОВІДНО на 17 - 32% і 25 - 43% (р < 0,01) у порівнянні зі значенням даного показника до лікування Дані клініко-лабораторного дослідження через 3 МІСЯЦІ також підтвердили наявність хронічного ендометриту й оофориту Приклад 2 Пацієнтка С , 20 років надійшла до КЛІНІКИ з діагнозом гостра екзема (іст хвороби №245/17) 3 метою прогнозування перебігу гострого запалення шкіри до лікування проведено дослідження суспензії моноцитів, що виділили з периферичної крові за стандартною методикою Отриману суспензію моноцитів розділили на 2 проби У контрольну пробу в якості агоністу Ргирецепторів додавали АТФ, шкубували протягом Юхв і спектрофотометричне визначали активність НАДФН-оксидази При концентрації АТФ 200мкМ активність НАДФН-оксидази in vitro склала 0,23 O-z - /хв/106 клітин (на 7 1 % менше, ніж у групі здоро 54087 вих жінок), ЩО відбиває зниження хемосенситивності Р2и-рецепторів У ДОСЛІДНІЙ пробі після додавання в інкубаційний розчин форболу мірістату ацетату в концентрації 25 нг/мл активність НАДФН-оксидази in vitro досягала 0,45 Ог - /хв/106 клітин, що на 95,6% перевищувало аналогічний показник у контрольній пробі Через 5 днів після призначення терапії - седативні препарати (настойка валеріани), імуномодулятор (левамізол), антипстамінні препарати (тавепл, лоратадин, пстаглобулін), вітаміни (біотин, пангамат кальцію, аскорбінова кислота) активність НАДФН-оксидази в контрольній пробі склала 0,26 О-А - /хв/106 клітин, а в дослідної - 0,58 О-А - /хв/106 клітин Зміни активності НАДФН-оксидази між дослідною і контрольною пробами склала 123,1% Оскільки різниця змін стимульованої активності НАДФН-оксидази моноцитів між контрольною і дослідною пробами до і після лікування складає 27,5% (більше 15%), то прогнозували видужання хворої Приклад 3 Пацієнт С , 20 років надійшов до КЛІНІКИ з діагнозом гострий перюдонтит (іст хвороби №1156/02) 3 метою прогнозування перебігу гострого запалення до лікування проведено дослідження суспензії моноцитів, що виділили з периферичної крові за стандартною методикою Отриману суспензію моноцитів розділили на 2 проби У контрольну пробу в якості агоністу Рги-рецепторів додавали АТФ, шкубували протягом Юхв і спектрофотометричне визначали активність НАДФНоксидази При концентрації АТФ 200мкМ активність НАДФН-оксидази in vitro склала 0,21 О2 /хв/106 клітин (на 74% менше, ніж у групі здорових осіб), що відбиває зниження хемосенситивності Р2и-рецепторів У ДОСЛІДНІЙ пробі після додавання в інкубаційний розчин форболу мірістату ацетату в концентрації 25нг/мл активність НАДФН-оксидази in vitro досягала 0,35 О-А - /хв/106 клітин, що на 66,7% перевищувало аналогічний показник у контрольній пробі Через 5 днів після призначення протизапальної терапії - сульфаніламідий препарат (бісептол), нестероідний протизапальний препарат (індометацин), вітаміни (біотин, пангамат кальцію, аскорбінова кислота), місцевий електрофорез калію йодиду, активність НАДФН-оксидази в контрольній пробі склала 0,24 О-А - /хв/106 клітин, а в ДОСЛІДНІЙ - 0,42 Ог - /хв/106 клітин Зміни активності НАДФН-оксидази між дослідною і контрольною пробами склала 75% Оскільки різниця змін стиму 8 льованої активності НАДФН-оксидази моноцитів між контрольною і дослідною пробами до- і після лікування склала 8,3% (менше 15%), то прогнозували перехід гострого запалення в хронічне Проведені через 1 місяць після закінчення лікування клініко-лабораторні дослідження підтвердили наявність хронічного перюдонтиту у хворого Приведені факти свідчать про те, що визначення стимульованої активності НАДФН-оксидази моноцитів периферичної крові хворих з гострим запаленням внутрішніх органів і шкіри дозволяє прогнозувати перехід гострого запалення в хронічне, а спосіб, що заявляється, є інформативним Використання способу прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри в хронічне запалення, що заявляється, дозволяє оцінити механізми виникнення, підтримки і завершення гострого запалення і, тим самим, підбирати патогенетичне обґрунтовану терапію хворих з гострими запальними захворюваннями Переваги способу, що заявляється, полягають утому, що він підвищує точність прогнозу гострого запалення, є технічно простим, економічним і високоінформативним, скорочує час для проведення досліджень Перераховані переваги визначають перспективність використання способу в хірурги, гінекологи, травматологи, терапії, дерматологи, стоматологи Спосіб, що заявляється, базується на дослідженнях in vitro, що виключає введення до організму різних індукторів чи інгібіторів, що регулюють функціональну активність клітин - учасниць запалення, і дозволяє уникнути побічних реакцій у пацієнтів, що обстежуються Іспиту способу, що заявляється, проведені на 30-ти пацієнтах з гострим запаленням внутрішніх органів і шкіри Джерела інформації, прийняті до уваги 1 Белокриницкая Т Е , Витковский Ю А Роль цитокинов в регуляции реакций иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности у родильниц с послеродовыми эндометритами - Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов 1998 -№1 -С 22-25 2 Масютин В А , Широков Д М Способ прогнозирования гнойных осложнений в посттравматическом периоде - Авторское свидетельство RU 95119291 -МПК G01 N33/48 - Оп 1998 06 10 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24