Спосіб діагностики розсіяного склерозу

Спосіб діагностики розсіяного склерозу, що включає визначення концентрації імуноглобуліну G у крові й цереброспінальній рідині, який відрізняється тим, що дослідження крові й цереброспінальної рідини проводять за допомогою динамічної міжфазної тензіометрії й додатково визначають концентрацію в крові й цереброспінальній рідині цитокинів і інтерферонів і, при значен 3 годин при 10000V. Після ІЕФ IPG смужки інкубують у буфері, що містить сечовину, 30% гліцерол, 2% додецилсульфат натрію, 0,5М трис-НСІ, 0,5% бромфенол блакитний протягом 10хв., потім фіксують 1% агарозою. Розподіл макромолекул проводять із використанням 9-16% вертикальних градієнтних поліакриламідних гелів, на які переносяться IPG стріпи. Розподіл білків по масах проходить при постійній силі струму, рівної 30mА на гель при температурі +10 С близько 5-6 годин. Візуалізацію білкових плям здійснюють методом фарбування срібла з тіосульфатом натрію. Це досягається протягом 3,5-4 годин з використанням 25% ізопропанолу, 10% оцтової кислоти, деіонізованної води, 0,1% нітрату срібла, 0,1% формаліну, 4%-ного безводного карбонату натрію, 0,002%-го розчину тіосульфату натрію, 0,1% формальдегіду. Тримають гелі в розчині 10%-ний оцтової кислоти не менш 1 години. Істотним недоліком цього способу є трудомісткість, висока вартість реагентів і устаткування, необхідних для здійснення цього способу. Дослідження ЦСР на наявність мінімум двох олігоклональних груп імуноглобулінів дозволяє лише побічно свідчити на користь PC, але не підтверджує діагноз. Імуноглобуліни можуть бути виявлені в ЦСР і при багатьох інших станах. Показник діагностичної точності у звичайній практиці не перевищує 65-70%. Наявність олігоклональних груп імуноглобулінів у ЦСР абсолютно не інформативно, якщо вони виявляються й у сироватці крові. В основу корисної моделі поставлено завдання створення способу діагностики PC, у якому забезпечується підвищення точності й інформативності способу за рахунок застосування динамічної міжфазної тензиіометрії (ДМТ) з визначенням поверхневого натягу ЦСР і крові, які визначають концентрацію поверхнево-активних речовин (ПАР) ліквору та крові, їхню в'язкість, адсорбцію й релаксацію. Поставлене завдання досягається тим, що в способі діагностики PC, що включає визначення в крові та ЦСР концентрації Ig G, відповідно до корисної моделі, дослідження крові та ЦСР проводять за допомогою ДМТ і додатково визначають концентрацію в крові та ЦСР цитокинов та інтерферонів і при значеннях поверхневого натягу (ПН) крові для чоловіків: ПН1 - 74,03±0,94; ПН2 70,80±0,82; ПН3 - 61,22±1,76; ПН4 - 48,07±2,88; КНК1 - 13,37±4,62; КНК2 - 164,32±36,27; 27,44±3,82; - 148,21±9,53; для жінок ПН1 75,60±0,82; ПН2 - 71,51±0,84; ПН3 - 62,19±1,33; ПН4 - 47,12±2,65; КНК1 -7,06±3,81; КНК2 155,64±45,21; - 25,34±4,52; - 139,87±8,65 та ПН ЦСР для чоловіків: ПН1 - 72,26±1,57; ПН2 70,88±0,86; ПН3 - 66,11±0,35; ПН4 -49,45±2,82; КНК1 - 15,30±3,45; КНК2 - 157,56±47,89; 23,67±3,17; -175,01±80,13; для жінок ПН1 73,34±1,28; ПН2 - 71,89±0,97; ПН3 -67,43±0,21; ПН4 - 48,32±3,25; КНК1 - 14,21±4,22; КНК2 156,38±50,23; -22,75±4,24; - 164,13±91,02 діагностують розсіяний склероз. Спосіб здійснюють у такий спосіб: Дослідження проводять на апараті «МРТ2» (LAUDA, Німеччина). 54536 4 Досліджувану рідину (1мл) поміщають у мікроосередок. У МРТ2 повітря від компресора через фільтр надходить у капіляр-опір. Об'ємну витрату повітря визначають по різниці тиску на кінцях капіляра за допомогою диференціального електричного перетворювача. Надлишковий тиск у системі, що використовується для розрахунку поверхневого натягу (ПН), вимірюють електричним перетворювачем тиску, а для оцінки частоти формування бульбашок застосовують високочутливий мікрофон. Крім акустичного є також кондуктометричний і фотоелектричний реєстратори частоти. Електричні сигнали від всіх вимірювальних систем надходять на електронний блок, а далі на компресор і електромагнітні клапани. Електронний блок через аналогово-цифровий перетворювач з'єднаний з персональним комп'ютером, звідки й здійснюють керування тензіометром. Процедури калібрування, тестування, вимірів і розрахунків у тензіометрі «МРТ2» повністю автоматизовані. Керуюча програма на вибір дозволяє здійснювати виміри із плавною або ступінчатою зміною частоти бульбашок у будь-якому напрямку й темпі, а також у режимі так званого зупиненого потоку (для оцінки результатів в області часів від 2 до 100сек). Оптимальним для досліджуваних рідин (кров і ЦСР) є комбінація вимірів у режимі частоти, що ступінчасто знижується утворення бульбашок з наступним автоматичним перемиканням на роботу в зупиненому потоці. Інформація про отримані результати вимірів представляється на екрані комп'ютера, її записують у вигляді, зручному для наступного зберігання, обробки, передачі в інформаційну мережу. Час, необхідне для одержання однієї повної динамічної тензіограми, становить 50 хвилин. Результати досліджень представляють у вигляді тензіограм (кривих залежності ПН від часу t), на яких визначаються точки, що відповідають t=0,001сек. (ПН1) і t=1сек. (ПН2), а також рівноважному ПН (ПН3), що відповідає t . Крім того, підраховуєть-1 ся кут нахилу кривої (КНК) у координатах ПН (t /2). Значення ПН1 характеризує властивості розчинника й адсорбцію в області коротких часів, а ПН2 в області середніх часів життя поверхні. Ці процеси обумовлені наявністю в біологічних рідинах низько- і середньо-молекулярних ПАР, тоді як для високомолекулярних фракцій білків і інших з'єднань визначальної є значення ПН3. Для визначення ПН на границях рідина-рідина або рідина-газ використовують метод висячої краплі - «ADSA». Спосіб здійснюють у такий спосіб: Дослідження проводять на установці по методу «ADSA» (Університет Торонто, Канада) зі зміненою конструкцією вимірювального осередку. Термостатуємий осередок складається із двох частин. У першу (знімну) частину поміщають краплю (0,5мл досліджуваної рідини). Циліндрична ванна всовується співвісно в термостатуючу оболонку - другу частину осередку (жорстко закріплену на оптичній лаві). Краплю біологічної рідини формують на сталевому капілярі із зовнішнім діаметром 2,7мм в атмосфері досліджуваної рідини, якою попередньо змочують внутрішню поверхню циліндричної частини осередку. Від відеокамери 5 сигнал надходить у відеопроцесор, де відбувається його трансформація з аналогового в цифровий. Елементи цифрової картини - пікселі, характеризуються певним числом рівнів яскравості. Число пікселів у методі «ADSA» дорівнює 640*480, а це означає, що якщо крапля займає по висоті 2/3 екрана монітора, то на видимий периметр краплі доводиться більше 1000 пікселів. Для визначення геометричної границі краплі використовують метод локального порога яскравості. В «ADSA» границю краплі визначають по максимальному градієнту яскравості й використовують поліноміальне згладжування кожної групи з п'яти послідовних точок на границі краплі. Середні точки кожної поліноміальної кривої розглядають як експериментальні точки профілю й використовують для розрахунку ПН. Для калібрування відеоустановки використовують еталонну оптичну сітку. Експериментальна погрішність по методу «ADSA» становить близько 0,1мн/м. Час необхідний для зняття й розрахунку одного експериментального профілю становить 35сек. Використовують нерівномірну тимчасову шкалу: виміри виконують через 5-10сек для перших 100-200сек від початку експерименту, потім через 20-30сек протягом наступних 20-30хв. і знову через 5-10сек після стресового розширення поверхні краплі наприкінці динамічного експерименту. Час первісного формування свіжої краплі становить 2-3сек, а стресової деформації поверхні краплі - близько 1сек. Дані «ADSA» істотно доповнюють результати «МРТ2» у діапазоні часів від 100 до 1000сек. При більше низьких значеннях t 1 /2=0,1с-1/2 (при часах життя >100сек), крива методу «ADSA» усе більше відхиляється від кривої методу «МРТ» убік більше низьких значень ПН. Здійснюючи екстраполяцію до нескінченного часу по даним «ADSA», одержують рівноважне значення ПН4 і тангенс кута нахилу цієї ділянки прямій КНК2. Значення ПН4 і КНК2 мають важливу діагностичну інформацію, оскільки вказують на наявність високоактивних компонентів досліджуваної рідині, які не фіксуються методом «МРТ». За допомогою «ADSA» вимірюють і в'язкоеластичність ( ), використовують швидку стресову деформацію розширення поверхні. Висока в'язкоеластичність адсорбційного монослою приводить до збільшення ПН. Після розширення краплі ПН повільно релаксує до свого первісного значення. Час релаксації ( ) є характеристикою здатності монослою відновлювати первісний стан, тобто відбиває кінетику адсорбції досліджуваної рідини й процеси перебудови станів адсорбованих молекул в умовах майже рівноважного монослою. Нами обстежено 148 хворих у віці від 17 до 65 років. З них: 76 пацієнтів з діагнозом - PC різної активності й стадії захворювання (основна група); 72 хворих з іншими органічними поразками центральної нервової системи (наслідки енцефаломієлиту, вірусний енцефаломієліт, ішемічний інсульт, пухлини головного мозку й нейросифіліс) група порівняння. Контрольна група представлена 30 людьми, у яких були виключені вище описані захворювання (практично здорові особи). Всім пацієнтам було проведено комплексне клініко-неврологічне й клініко-лабораторне дослі 54536 6 дження, що включало в себе дослідження неврологічного статусу, ретельний аналіз анамнестичних даних, дослідження біохімічних показників крові й імунного статусу, магнітно-резонансна томографія головного й спинного мозку. Всім обстеженим проведена ДМТ крові й ЦСР методами «МРТ2» і «ADSA». При зіставленні результатів клініконеврологічного обстеження й ДМТ крові й ЦСР виявилося, що у всіх хворих PC виявлялися подібні зміни ПН, КНК, і у порівнянні із групою порівняння й контрольною групою. Крім того, відзначалися зміни ДМТ ЦСР і крові у хворих PC із різними типами й стадіями перебігу захворювання. Приводимо конкретні приклади здійснення заявленого способу. Приклад 1 Хвора К., 24 років, історія хвороби №8595, поступила в клініку нервових хвороб Донецького обласного клінічного територіального медичного об'єднання в плановому порядку 14.04.02р. При надходженні пред'являла скарги на відсутність зору на обидва ока, відсутність рухів у ногах, слабість у руках більше лівій, біль у спині, що підсилювалась при русі, оніміння лівої руки, утруднення утримання сечі, запори. З анамнезу відомо, що в серпні 1999 (після стресу) відзначила оніміння 4, 5 пальців лівої руки - відсутність рухів у лівій руці, у листопаді 1999 року - відсутність рухів у ногах, порушення сечовипускання, у січні 2000 року - погіршення зору. Проведена терапія судинними, нестероідними протизапальними препаратами, ноотропами, полівітамінами ефекту не дала. Об'єктивно при дослідженні неврологічного статусу виявлено: ейфорична, VOU-0, м'язова сила знижена в проксимальних відділах рук, у ногах спастична параплегія, сухожильні рефлекси з рук високі S>D, колінні - оживлені, рівні, ахілові - клонуси, позитивні патологічні стопні знаки, черевні рефлекси відсутні, анестезія з Th5 донизу по провідниковому типу, гіперпатія стоп, знижене м'язово-суглобне почуття, більше в ногах Диференційний діагноз проводився між метастатичною поразкою нервової системи й демієлінизуючим захворюванням. Проведене лабораторне дослідження виявило: ACT - 24Е/л, АЛТ - 26Е/л, ЩФ 403Е/л, фібриноген - 2,75г/л, фракції білків крові альбумін 49,1%, альфа1 - 3,4%, альфа2 - 10%, бета - 12,1%, гама - 25,5%, загальний білок - 70 г/л, загальний холестерин - 4,4г/л, тригліцеріди 1,4ммоль/л, ХС ЛПНП - 1,1ммоль/л, ХС ЛПОНП 0,6ммоль/л, ХС ЛПВП - 1,3ммоль/л, беталіпопротеіди - 3,4г/л. Імунограма крові: IgA - 2,7г/л, IgM -1,21г/л, IgG - 19,4г/л. Аналіз ЦСР: безбарвна, ясна, клітки - 0мм3, білок 0,4г/л, Панди+1. IgG ліквору