Спосіб оцінки морфофункціонального стану ембріональних мезенхімних структур

1. Спосіб оцінки морфофункціонального стану ембріональних мезенхімних структур шляхом морфометричних досліджень, за яких на цифрову фотографію стандартного гістологічного зрізу ем 3 [1], а розрахунок стереометричних параметрів проводять із накладанням сітки Автанділова на роздруковані фотознімки. При цьому визначають показники питомої щільності клітин різних типів та структурних елементів тканини. Визначені показники порівнюють із стандартними значеннями та роблять висновок про наявність та характер патологічних змін у тканині. Недоліками цього способу є обчислення параметрів одразу багатьох тканинних компонентів (10), що є досить клопітким процесом, а також висока суб'єктивність результатів, яка пов'язана з необхідністю диференціювання дослідником вищезгаданих компонентів тканини, що не завжди можливо без використання імуногістохімічних методик (використання яких не доцільне в даному випадку). В основу корисної моделі, що пропонується, поставлено задачу розробити широкодоступний спосіб оцінки морфо-функціонального стану ембріональних мезенхімних структур, який скорочує час, підвищує точність результату та надає можливість судити про наявність та характер патологічних відхилень. Технічний результат від використання запропонованої моделі полягає в полегшенні методики, зменшенні матеріальнотехнічних витрат, зменшенні часу, що витрачається на обчислення та підвищенні об'єктивності результатів. Поставлена задача вирішується тим, що на цифрових знімках мезенхімних структур з допомогою широкодоступного неспеціалізованого програмного забезпечення визначається чисельна щільність ядер мезенхімних клітин та порівнюється із значеннями контролю. Для здійснення даного способу ми обрали і саме мезенхімні структури, оскільки в основі їх утворення лежить динамічний, але строго регульований процес епітеліомезенхімної трансформації, тобто постійне новоутворення клітин мезенхіми з епітелію. При цьому, оскільки клітини вільно розташовуються в основній речовині, кількість їх ядер (яка додатково залежить від процесів мітозу та синтетичної активності клітин у відношенні продукції позаклітинного матриксу) може бути легко обчислена. : Заявлений спосіб здійснюється таким чином: 1. Для аналізу відбирають цифрові фотографії гістологічних зрізів ембріонів, які проходять через центральну вісь симетрії мезенхімної структури. При цьому товщина зрізів має бути не більшою за 7 мкм. 2. Для визначення розмірів фотознімку використовують цифрове зображення об'єктмікромстра, отримане на тому самому мікроскопі з допомогою такої ж цифрової фотокамери; з допомогою інструменту «Ruler» головної панелі інструментів вимірюють ширину та висоту знімку в мікрометрах (за умови постійного використання однакових технічних пристроїв та збільшення мікроскопа дана процедура проводиться однократно). 3. На цифровому зображенні мезенхімної структури з допомогою лічильника «Count tool» визначають кількість ядер мезенхімних клітин (Фіг.1). 55038 4 4. В команді головного меню «Image» обирають «Image size» та отримане значення ширини (Width) знімку в пікселях ділять на значення ширини фотографії в мікрометрах. Емпіричним шляхом підбирають необхідне значення довжини ребра комірки сітки Автанділова у мікрометрах та множать його на отримане співвідношення, - отримують значення довжини комірки у пікселях. 5. Визначення площі поверхні, яку займає зріз мезенхімної структури, проводять наступним чином: в команді головного меню «Edit» обирають «Preferences→Guides, Grid, Slices & Count» та у комірці «Grid every» позначають; потрібную кількість пікселів (визначену у попередньому пункті). У команді уголовного меню обирають «View→Show→Grid» та рахують кількість комірок, сітки, які повністю припадають на досліджувану структуру та половину тих, які припадають частково (наприклад, з правої половини зображення). Отримане значення кількості комірок множать на значення довжини ребра комірки у мікрометрах у квадраті (Фіг.2). 6. Отримане значення кількості ядер мезенхімних клітин (з п.3) ділять на значення площі поверхні мезенхімної структури та отримують чисельну щільність ядер мезенхімних клітин, яку порівнюють із даними графіку і визначають приналежність до тієї чи іншої стадії розвитку або характер патологічних відхилень (Фіг.3). Запропонований алгоритм може бути використаний у відношенні таких ембріональних мезенхімних структур як ендокардіальні подушки атріовентрикулярного каналу, випускного тракту серця, поперечна перегородка та ін. Окрім того, оскільки процес епітеліо-мезенхімної трансформації лежить в основі виникнення багатьох пухлин, можливо також створення подібних графіків для визначення ступеню їх злоякісності і т.п. Використання способу визначення морфофункціонального стану ембріональних мезенхімних структур за наведеною схемою дозволяє достатньо легко, швидко і точно встановити навіть незначні відхилення від нормального розвитку. Запропонована корисна модель може бути багаторазово відтворена і використана для стереометрії в ембріології, патологічній анатомії, гістології, анатомії. Перелік фігур креслення Додаток 1. Підрахунок кількості ядер (59) мезенхімних клітин на цифровому зображенні гістологічного зрізу проепікарда курячого ембріона кросу Соbb500 на 17 стадії розвитку за Гамбургером та Гамільтоном, 1951. 2. Визначення площі поверхні проепікарда на гістологічному зрізі. Загальну і кількість підрахованих комірок (56) множимо на довжину ребра сітки у квадраті (400), отримують значення площі в мкм (22 400). Отже чисельна щільність ядер мезенхімних клітин, - 0,26341 (1/100мкм2), - знаходиться в межах норми. 3. Динаміка чисельної щільності ядер мезенхімних клітин про епікарда курячого ембріона кросу Соbb500, 1/100мкм2. Джерела інформації 5 1. ВидеоТесТ-Размер 5.0 Программное обеспечение для работы с изображениями. Электронный ресурс [http://www.akondmicro.ru/?issue_id=75]. 2. ВидеоТесТ-Морфология 5.0 Программное обеспечение для морфометрического анализа биологических и медицинских изображений. Электронный ресурс [http://www.akondmicro.ru/?issue_id=75] 3. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию.- М.: Медицина, 1980.- 216с. 4. Hamburger V.A. series of normal stages in the development of the chick embryo / Viktor Hamburger, Howard L. Hamilton // J. Morphol. - 1951. - Vol.88, №1. - P.49-92. 55038 6 5. Martinsen B.J. Reference guide to the stages of chick heart embryology / Brad J. Martinsen // Developmental dynamics. - 2005. - Vol.233. - P.12171237. 6. MetaMorph - image acquisition and analysis software from Molecular Devices. [Електронний ресурс] http://www.moleculardevices.com/pages/MMnew/metamorph_appl ications.html. 7. Пат. 47118 Україна, МПК А61В10/00. Спосіб оцінки морфо-функціонального стану тестикулярної тканини / Запорожан Валерій Миколайович (UA); Холодкова Олена Леонідівна (UA); Щербатюк Аліна Леонідівна (UA); Пихтєєв Дмитро Михайлович (UA); Одеський державний медичний університет. - №u200911259; заявл. 06.11.2009, опубл. 11.01.2010. 7 Комп’ютерна верстка О. Рябко 55038 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601