Спосіб лікування шкірно-м’язових ран та подолання дефіциту донорських ресурсів шкіри

Спосіб лікування шкірно-м'язових ран та подолання дефіциту донорських ресурсів шкіри, який включає виділення фібробластів, проведення ранніх некректомій, який відрізняється тим, що виділяють суміш кератиноцитів та фібробластів із шкіри хворого, проводять ферментизацію, розділяють шкіру на дерму та епідерміс з наступною безпосередньою трансплантацією на рани, донорські поверхні, іммобілізуючи в підготовлену нативну, девіталізовану, ліофілізовану ксено-, ало- та автодерму. Корисна модель відноситься до медицини, а саме до біотехнології і медицини, зокрема до хірургії та комбустіології. Відомим є спосіб комбінованої економної шкіряної пластики, який передбачає виконання ранніх етапних поширених некректомій; тимчасове закриття ранових поверхонь ксеношкірою; відновлення шкіряного покриву методами автодермопластики, економними сітчастими трансплантатами - в тому числі. [Таран В.М. Раннє хірургічне лікування обпечених //Шпитальна хірургія. -№4. -1999. -С.72-77; Бігуняк В.В., Савчин B.C., Лучанко Л.І. та інші/УШпитальна хірургія.-№4.-1999.-С. 104-108]. Відомим є спосіб використання алогенної шкіри від живих донорів з застосуванням імуносупресивних препаратів. Спосіб передбачає: виконання ранніх етапних поширених некректомій; тимчасове закриття ранових поверхонь алогенною живою шкірою під прикриттям імуносупресивної терапії; поступове відновлення шкіряного покриву методами автодермопластики. [Вихриев Б.С., Бурмистров В.М. - Ожоги. - Л.: Медицина, 1986.-С.43-47]. Недоліки способу пов'язані з тим, що використання живої алогенної шкіри передбачає наявність живого донора шкіри, а необхідність в проведенні імуносупресивної терапії у реципієнта супроводжується ризиком як відторгнення пересадженої шкіри, так і ризиком виникнення інфекційних ускладнень на фоні поглибленого вторинного імунодефіциту. У зв'язку з чим спосіб використовується дуже рідко. Перелічені способи хірургічного лікування опікових та шкірно-м'язових ран мають ран слідуючи недоліки. При поширених некретоміях, які виконуються на 1-5 добу від травми дефіцит донорських ресурсів шкіри позначається надто швидко, а можливі ускладнення при виконанні автодермопластики (лізис трансплантатів та нагоєння донорських ран сприяють його зростанню та можуть привести, майже, до летального кінця. Найбільш близьким і обраним за прототип є біотехнологічний спосіб з використанням вирощених in vitro алогенних фібробластів, який передбачає виконання ранніх етапних поширених некректомій; пересадку на рани вирощених in vitro алогенних фібробластів, відновлення шкіряного покриву методом сітчастих автодермотрансплантатів з великим коефіцієнтом перфорації 1:6-1:8. [Федоров В.Д., Саркисов Д.С., Алексеев А.А. //Применение культуры фибробластов для лечения тяжело обожженных.-Анн.хир.-1999.-№4.-с. 16-20]. Позитивними сторонами способу є зниження травматичності хірургічного лікування в першу чергу за рахунок мінімальних розмірів донорських ран. Біотехнологічний спосіб потребує екстракорпорального культивування фібробластів і кератіноцитів в умовах спеціально обладнаних лабораторій, використання дефіцитних спеціальних розхідних матеріалів високої вартості. Клітинні CD 5671 трансплантати надто уразливі під впливом ушкоджуючих факторів рани та оточуючого середовища, в зв'язку з чим їх приживлюваність на рані коливається від 20-30% і потребує спеціального захисту клітин на рані. Задача переносу клітинних трансплантатів з лабораторного посуду на рану також потребує окремого вирішення. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу лікування шкірно-м'язових ран та подолання дефіциту донорських ресурсів шкіри, в якому за рахунок суттєвого скорочення і зміни процедури культивування клітин, досягається відновлення цілісності шкірного покриву і скорочення термінів загоєння шкірно-м'язових ран, подолання дефіциту донорських ресурсів шкіри, спрощення технології. Поставлена задача вирішується в способі лікування шкірно-м'язових ран та подолання дефіциту донорських ресурсів шкіри, який містить виділення фібробластів, проведення ранніх некректомій , згідно з корисною моделлю, виділяють суміш кератиноцитів та фібробластів із шкіри хворих, проводять ферментизацію, розділяють шкіру на дерму та епідерміс з наступною безпосередньою трансплантацією на рани, донорські поверхні, іммобілізуючи в підготовлену нативну, девіталізовану, ліофілізовану ксено, ало- та автодерму. При здійсненні способу досягаються наступні технічні результати: Технологія виготовлення трансплантату цілком відповідає задачам раннього хірургічного лікування, оскільки перший може виготовлятись паралельно з підготовкою хворого до первинної некректомії, а також може бути виготовлений заздалегідь. Для відновлення шкіряного покриву використовується проліферуюча фрація кератиноцитів хворого та дермальні фібробласти, які культивуються в умовах in vivo, в осередку вологого середовища, під захистом природної матриці дерми від пошкоджуючи факторів рани та оточуючого середовища. Використання первинно-дисоційованих проліферуючих кератиноцитів, їх культивування безпосередньо на рані, дононорській поверхні під захистом і в умовах природної матриці сумісно кератиноцитів і фібробластів, реалізуючих необхідні епітеліомезенхімальні відносини, при загоюванні рани відповідає критерію "новизни". Підготовка клітин до трансплантації, нанесення їх в структурований матрикс, виключення необхідних етапів обробки клітин ферментами та розчином Версена, їх неодноразове центрифугування і пікетування, виключення необхідності переносу культивованих клітин в умови "старої"" рани; швидке виготовлення придатного для одноразової пересадки трансплантату створюють у сукупності їх функціональної єдності для досягнення поставленої мети відповідно критерію "суттєві відзнаки". Новий позитивний ефект складається із можливостей: - спрощення технології культивування клітин шкіри постраждалих за рахунок суттєвого скорочення і зміни процедури культивування клітин, для якого не потрібні дорога апаратура, обладнання, спеціальний посуд для культивування , живильні середовища, ростові добавки, та інші розхідні матеріали великої вартості. Одноразові маніпуляції з клітинами, виключення етапів їх трипсинизації, центрифугування запобігає можливості травмування пересаджених клітин, т.ч. підвищується ефективність їх лікування. Таким чином запропонована технологія забезпечує позитивний ефект. Спосіб відновлення цілісності шкірного покриву здійснюється таким чином: під місцевим знеболюванням беруть фрагмент із неушкодженої ділянки шкіри товщиною 0,4см і розміром 1-7см2, з якого готують клітинну суспензію шляхом ферментизації (трипсин, каназа, коллагеназа, хемотрипсин при +4-37°С). Фрагмент автошкіри розділяють на дерму і епідерміс. Механічно обробляють дерму (піпеткування), одержуючи при цьому суспензію клітин, що складається з 60-80% кератиноцитів і 40-20% дермальних фібробластів, що фільтрують через марлевий фільтр, центрифугують. Отриману свіже виготовлену звісь кліток доводять до концентрації 1-0,5млн кліток у 1мл. Дермальний та ксенодермальний трансплантат підготовляють для ведення в нього клітинної суспензії. Для цього інкубують його в живильному середовищі 10% сироваткою ембріонів корів 3040хв при +4-37°С. У підготовлений нативний, девіталізований, ліофілізований ало-, авто -чи ксенодермальний трансплантат шляхом інокуляції в товщу дерми вводять тонкою голкою клітинну суспензію в дозі 0,1мл у інокулу на відстані 2см друг від друга по спеціальному шаблону з посівною дозою 5-10-104 на 1см 2 дермальної поверхні. Через 10-14 діб на місці трансплантації відновлюється шкірний покрив шляхом безпосереднього культивування in vitro епідермоцитів хворого. Цю ж суміш можливо вводити шляхом інокуляції клітин безпосередньо в тканини дна ранового дефекту, обов'язково прикриваючи біологічним покриттям, або неприлипаючою парафінізованою пов'язкою для збереження вологого середовища у рані з температурним, газовим оптимумом. При необхідності для подальшого культивування автоклітин в ксенодермі, трансплантат розкладають у пластикові чашки Петрі, на колагеновий гель, на межі живильного середовища (середа Ігла з подвійним набором амінокислот і 10% сироватки ембріонів корів з додаванням антибіотиків по 100од/мл пеніциліну і стрептоміцину) і повітряного середовища (з 5-10% СОг) витримують у термостаті при +37°С 1-5 діб. При виникненні потреби використовують підготовлений і витриманий у такий спосіб трансплантат методом накладення на область шкірно-м'язового дефекту та його фіксації на рані. Потім шляхом ферментизації (трипсин, каназа, коллагеназа, хемотрипсин при +4-37°С) фрагмент автошкіри розділяють на дерму і епідерміс. Механічно обробляють дерму (піпеткування), одержуючи при цьому суспензію клітин, що складається з 60-80% кератиноцитів і 40-20% дермальних фібробластів, що фільтрують через марлевий фільтр, центрифугують. Отриману свіжевиготовлену звісь кліток доводять до концентрації 10,5млн кліток у 1мл. 5671 Дермальний та ксенодермальний трансплантат підготовляють для ведення в нього клітинної суспензії. Для цього інкубують його в живильному середовищі 10% сироваткою ембріонів корів 3040хв при +4-37°С. У підготовлений нативний, девіталізований, ліофілізований алло-, ауто- чи ксенодермальний трансплантат шляхом інокуляції в товщу дерми вводять тонкою голкою клітинну суспензію в дозі 0,1мл у інокулу на відстані 2см друг від друга по спеціальному шаблону з посівною дозою 5-10-104 на 1см 2 дермальної поверхні. Через 10-14 діб на місці трансплантації відновлюється шкірний покрив шляхом безпосереднього культивування in vitro епідермоцитів хворого. Підготовлений трансплантат зберігають до використання 2-5 діб при +4°С у вологому середовищі або культивування в умовах термостату. Приклад. Спосіб апробовано і реалізовано при лікуванні ранового дефекту шкіри у щура після первинної некректомії (висічення післяопікового некрозу) шляхом пересадки первинної взвісі автологічних клітин шкіри, імобілізованих в ксенодермотрансплантат. 19.01.2004 р. На спині у щура лінії Вістар, масою 180г, під анестезією гексаналу нанесений контактний опік IV ступеню за допомогою пристрою до електричного паяльника. Температура робочої поверхні пристрою складала 350°С, експозиція 10", площа опіка 7см 2 . Асептична пов'язка. На другому боці вирізано повно шаровий клапоть неушкодженої шкіри площею 7см 2 , який ушитий наглухо. Асептична пов'язка. Фрагмент шкіри оброблено в розчині антибіотиків, перенесено в теплий розчин ферменту та розміщено у термостаті при +37°С на 4 години. Після цього тканину клаптя розділено на дермальну та епідермальну частину. З останньої механічно, пікетуванням ви Комп'ютерна верстка А Крижанівський ділені клітині в дозі 1млн в 1мл, продовженням трипсинізації виділені фібробласти. Життєздатність клітин по тесту трипанового синього склала 93%. Суміш клітин введена в товщу гідратованого клаптя ксеношкіри і відправлено для зберігання в термостаті на гелеву підложку в чашці Петрі. На другу добу під гексеналовим наркозом опіковий некроз висічено в межах непошкоджених тканин. В створений рановий дефект вшито ксенодермотрансплантат з ауто клітинами та пластикове кільце для запобігання концентричного стягування рани. При огляді рани 22.01.2004 ексудації в оперованій зоні немає. Ксенотрансплантат теплий, макроскопічно життєздатний. На 7 добу ксенотрансплантат почав підсихати з країв і повністю відокремився на 15 добу. Після цього на всій площі дефекту був виявлений неоепітелій. Взято біоптат. При вивчені морфологічних структури виявлено наявність декілька шарів кератиноцитів, утворюючих пряму риску при поєднанні з дермальною поверхнею, міжклітинні зв'язки виражені слабо. Повна епітелізація рани з появою диференційованого епітелію зареєстрована на 21 добу. Таким чином, запропонований спосіб відновлення шкірного покриву включає підготовку трансплантата шляхом заповнення його клітинною суспензією, яка складається із свіжевиготовлених кератиноцитів і фібробластів, переносі готового трансплантата відразу ж безпосередньо на шкірно-м'язову рану або інокуляція клітин в тканини дна рани після первинної некректомії. Спосіб дозволяє скоротити терміни загоєння шкірно-м'язових ран, зменшити травматичність операції відновлення шкіряного покриву, порівняльне з автодермопластикою, подолати дефіцит донорських ресурсів шкіри. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601