Похідні піридин-2,6-дикарбонової кислоти як індуктори g-інтерферону

Похідні піридин-2,6-дикарбонової кислоти формули Винахід відноситься до біоорганічної хімії, зокрема до синтезу індукторів інтерферону, і може бути використаний для створення нових противірусних та протипухлинних засобів. Індуктори інтерферону являють собою найперспективніший клас противірусних та протипухлинних препаратів [Ершов Ф.И., Новохатский A.C. Индукторы интерферона. - М.: Медицина, 1982, 180с.]. У зв'язку з Чорнобильскою катастрофою та підвищенням частоти онкологічних захворювань серед населення України особливо актуальним є створення нових протипухлинних препаратів з імунокорегуючими властивостями. Такими препаратами є індуктори -інтерферону, зокрема синтетичний полінуклеотид полі(І)-полі(Ц), полісахарид природного походження зимозан. Усі ці сполуки є високомолекулярними індукторами та характеризуються значними побічними ефектами, зокрема токсичністю та алергенністю [Иванова A.M. Эффективность новых высоко- и низкомолекулярных индукторов интерферона при экспериментальных вирусных инфекциях: Дис... канд. биол. наук.: 03.00.06. - М., 1991. - 260с.]. Крім того, для їх використання необхідно застосовувати ін'єкційний шлях введення або спеціальні лікарські форми, що запобігають деградації індукторів у шлунку. Синтетичні низькомолекулярні індуктори -інтерферону, які були б придатні для внутрішнього застосування, заявнику невідомі. Відомо, також, що аміксин (4) індукує усі типи інтерферонів, але здебільшого - - та -типу, а інтерферон - лише у незначній мірі [Андронати С.А., Литвинова Л.А., Головенко Н.Я. Пероральный индуктор интерферона "Амиксин" и его аналоги // Журн. АМН Украины. - 1999. - Т.5, №1. - С.5366]. , де Y1 = Y2 = H, Н або Y1 = H, Н; Y2 = T, або Y1 = Y2 = Т, при цьому (11) 59034 (13) C2 , (19) UA як індуктори  -інтерферону. В основу винаходу поставлено задачу створити синтетичні низькомолекулярні індуктори інтерферону, які здатні індукувати переважно інтерферон. Поставлена задача вирішена синтезом сполук загальної формули: 3 1: N2, N6-дигідразинокарбонілметил-2,6гаридиндикарбоксамід (Y1 = Y2 = Η, Η) 2: Піридин-2,6-дикарбонової кислоти 2-{[2,7біс-(2-діетіламіноетокси)-флуорен-9-іліденгідразинокарбонілметил]-амід}6гідразинокарбонілметил-амід (Y1 = Η, Η; Υ2 = Τ) 3: Піридин-2,6-дикарбонової кислоти біс-{[2,7біс-(2-діетіламіноетокси)-флуорен-9-іліденгідразинокарбонілметил]-амід} (Y1 = Y2 = Τ) де Отримання сполук, що заявляються, підтверджуються наступними прикладами. Приклад 1. N2,N6-дигідразинокарбонілметил2,6-піридин-дикарбоксаміду (1). Спочатку отримували піридин-2,6дикарбонової кислоти дихлорангідрид (6), для чого кип'ятили 12 годин суміш 1,67г (0,01моль) піридин2,6-дикарбонової кислоти (5), 1мл диметилформаміду і 50мл тіонілхлориду. Реакційну суміш випарювали у вакуумі до сухого стану. Сухий залишок промивали 10мл петролейного етеру, екстрагували діетиловим етером. Екстракт випарювали у вакуумі до сухого стану, а сухий залишок, що являє собою дихлорангідрид (6), використовували без подальшої очистки та ідентифікації для синтезу етил-2-(6-етоксикарбонілметилкарбамоїл-2-тридинкарбоксамідо)-ацетат (7). Для цього до розчину 10г карбонату натрію і 5г бікарбонату натрію в 50мл води додавали 20мл суміші хлористого метилену та діетилового етеру (1:1). Суміш охолоджували до 0 °С і додавали 10ма порціями 3г (0,022моль) гідрохлориду етилового естеру гліцину. До одержаної суміші додавали при 0°С та інтенсивному перемішуванні розчин 2,03г (0,01моль) дихлорангідриду піридин-2,6 59034 4 Сполуки, що заявляються, одержували за схемою, що наведена далі. Обробкою піридин-2,6дикарбонової кислоти надлишком хлористого тіонілу у присутності каталітичної кількості ДМФА синтезували хлорангідрид, реакцією якого з етиловим естером гліцину у водно-органічному середовищі у присутності карбонат-бікарбонатного буферного розчину отримували відповідний діестер. Гідразиноліз останнього дією гідразингідрату у метанолі приводив до біс-гідразиду (1). Реакція останнього з аміксином дає суміш гідразонів 2 та 3, яку розділяли на індивідуальні речовини вибірковою екстракцією. Детальні методики синтезу приведені в прикладах 1-3. дикарбонової кислоти (6) в 10мл суміші хлористого метилену і діетилового етеру (1:1). По закінченні додавання температуру поступово підвищували до кімнатної і перемішували 8 годин. Після завершення перемішування додавали 50мл хлористого метилену, органічний шар відокремлювали, водний шар екстрагували хлористим метиленом, об'єднані органічні шари промивали насиченим розчином хлориду натрію, висушували сульфатом натрію, розчинник випарювали у вакуумі до сухого стану. Цей естер 5 і використовували для синтезу сполуки 1. Розчиняли 3,37г (0,01моль) сполуки 5 в 10мл метанолу, додавали 2мл 100% гідразингідрату і кип'ятили 8 годин. Осад, що випав, відфільтровували, промивали на фільтрі льодяним метанолом (210мл), водою (350мл) і висушували у вакуумі. Фізико-хімічні властивості одержаної сполуки наведені в таблиці. Приклад 2. N2-гідразино-N6-{[2,7-ди-[2(діетиламіно)етокси]-9Н-9флуореніліденогідразинокарбонілметил}-2,6піридиндикарбоксамід (2). Розчин 3,09г (0,01моль) сполуки 1, 12,3г (0,03моль) 2,7-ди-[2-(діетиламіно)етокси]-9Н-9-флуорену і 6мл (0,1моль) льо 5 59034 6 дяної оцтової кислоти кип'ятили у 25мл етанолу (діетиламіно)етокси]-9Н-9-флуорпротягом 12 годин. В реакційну суміш додавали еніліденогідразинокарбонілметил}-2,6250мл 10% розчину аміаку та екстрагували бензопіридиндикарбоксаміду (3). Гептановий екстракт, що отримували при синлом (550мл). Екстракт промивали насиченим ротезі сполуки 2, охолоджували до 0°С та відфільтзчином хлориду натрію (250мл), висушували і ровували осад, що випав. Осад перекристалізовубензол випаровували у вакуумі до сухого стану. вали з гептану. Фізико-хімічні властивості Сухий залишок екстрагували киплячим гептаном одержаної сполуки наведені в таблиці. (250мл). Залишок є сполукою 2. Приклад 3. N2,N6-ди-{2,7-ди-[2Таблиця Склад, молекулярна вага, температури плавлення, значення мас молекулярних іонів та інтерфероніндукуюча активність сполук, що заявляються Сполука 1 2 3 4 Бруто-формула C11H15N7О4 C36H47N9O6 C61H79N11O8 Аміксин Τ пл., °С 248-249 >213 (р) 202-203 Знайдено, % С Η Ν 42,82 4,91 31,79 61,70 6,69 18,01 67,02 7,38 14,21 + [М ] 309 701 1093 Титр інтерферону pH=7 рН=2 1 40 1280 >1280 40 >1280 0 160-320 320-640 1 Примітки до таблиці. Деяке підвищення титрів інтерферону після кислої обробки може мати місце внаслідок гідролізу баластних протеїнів та вивільнення інтерферону з комплексу з ними. Інтерфероніндукуючу дію сполук оцінювали загальноприйнятими методами. Для первинного скринінгу препаратів використовували лейкоцити крові донорів 0(1) групи. Визначення активності утвореного інтерферону проводили на первинно-трипсинізованій культурі клітин шкірно-м'язової тканини ембріонів людини (ШМТЕЛ), чутливих до -та -інтерферону. Клітини 6 в концентрації 3-10 кл./мл вирощували у планшетах з плоским дном в об'ємі 0,2мл при термостатуванні при 37°С в атмосфері з 5% СО2. Для вирощування клітин використовували середовища 199 та Ігла у співвідношенні 1:1 з додаванням 10% сироватки крові великої рогатої худоби, інактивованоі при 56°С протягом 30хв, та антибіотиків. Середовище підтримки (С) складалось з середовищ 199 та Ігла з 2% сироватки. Експеримент складався з двох етапів; визначення індукції інтерферону та визначення активності інтерферону. Визначення індукції інтерферону До суспензії лейкоцитів людини додавали досліджуваний препарат, розчинений у середовищі 199 до концентрації 10-100мкг/мл. Через 24год у культуральній рідині визначали наявність інтерферону і його активність. Визначення активності інтерферону Готували двократні розведення досліджуваної культуральної рідини (з попереднього етапу) в середовищі 199. На кожне розведення використовували по 4 лунки з клітинами. Попередньо з них зливали поживне середовище, промивали чистим середовищем 199 і додавали на 24год до кожної лунки по 0,1мл досліджуваної культуральної рідини, 4 лунки залишали для контролю, замінивши в них поживне середовище на підтримуюче. Визначення інтерферону проводили за допомогою індикаторного вірусу, а саме вірусу везикулярного стоматиту (ВВС). Вірус заздалегідь титрували на культурі L41 і використовували у дозі 100 ТЦД50. До кожної лунки додавали визначену дозу ВВС, для контролю вірусу використовували 4 лунки на кожне його десятикратне розведення від 100 до 0,1 ТЦД50. Дослідні і контрольні планшети інкубували 24-48год у термостаті при 37°С. Як препарат порівняння використовували лаферон - відомий препарат інтерферону з відомою активністю в міжнародних одиницях (МО), який позначався як стандартний зразок (СЗ). Дослід з ним ставили паралельно з основним для порівняння дії препарату, що вивчається. Визначення активності інтерферону здійснювали через 24-48год, коли доза внесеного ВВС (100 ТЦД50) викликала повну дегенерацію клітин у контролі вірусу (KB) за відсутності дегенерації в неінфікованій культурі. За титр інтерферону в ОД (одиницях дії) приймали величину, зворотну розведенню препарату, при якому культура клітин в 50% лунок була повністю захищена від цитопатогенної дії індикаторного вірусу. Розрахунок активності інтерферону в МО проводили за формулою: А Х  Т Х  СЗ , де Т СЗ ΤХ - титр зразка (в ОД/мл), що вивчається, АСЗ - активність стандартного зразка (в МО), ТСЗ - титр стандартного зразка (в ОД/мл), X - активність інтерферону, індукованого в досліді препаратом, що вивчається, виражена в МО/мл, ОД - титр інтерферону в дослідній групі, МО - міжнародні одиниці, чисельник - активність інтерферону - СЗ в МО, яка відома заздалегідь, знаменник - титр інтерферону СЗ, отриманий в даному досліді і виражений в одиницях дії, зворотних до розведення препарату. Тип індукованого інтерферону визначали за кислотостійкістю для -інтерферону чи кислоточутливістю для -інтерферону. Для цього, до зразка 7 59034 8 культурального середовища після визначення тифармакологічний центр., Київ, 2001. С.390-392]. тру інтерферону додавали 4Н НСІ до pH=2, інкуЗначення титрів інтерферону, індукованих бували 4 доби при 4°С, після чого додаванням 4Н сполуками, що заявляються, наведені у таблиці. розчину NaOH підвищували pH до рівня 7,2 та Значне зниження отриманих титрів після кислої знову визначали титр інтерферону. Різницю між обробки (у випадку сполук 2 та 3) культурального першим та другим визначенням титру інтерферону середовища свідчить, що індукований інтерферон відносили до -інтерферону, а решту активності, належить до родини -інтерферонів [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекощо залишалась після кислої обробки - до мендації. За редакцією член-кореспондента АМН інтерферону. України О.В. Стефанова. / Міністерство охорони [Доклінічні дослідження лікарських засобів. здоров'я України. Державний фармакологічний Методичні рекомендації. За редакцією членцентр, Київ, 2001. С.392]. кореспондента АМН України О.В. Стефанова. / Міністерство охорони здоров'я України. Державний Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601