Похідні акридиніл-9-гідразиду амінооцтової кислоти як індуктори інтерферону

Винахід відноситься до біоорганічної хімії, зокрема до синтезу індукторів інтерферону, і може бути використаний для створення нових противірусних та імунокорегуючих засобів. Індуктори ендогенного інтерферону являють собою найперспективніший клас противірусних препаратів та імунокоректорів [Ершов Ф.И., Ново хатский А.С. Индукторы интерферона. - М.:Медицина, 1982, 180с.]. Різноманітність вірусів та внутрішньоклітинних паразитів (збудників чисельних захворювань людини та тварин), що характеризуються різною стратегією реплікації та різною біохімією, визначає актуальність поширення списку ефективних засобів для лікування та профілактики захворювань, що спричиняються цими збудниками. Найближчим аналогом до винаходу, що заявляється, виходячи з біологічної активності є аміксин противірусний препарат та індуктор інтерферону, здебільшого a - та b - типу [Андронати С.А., Литвинова Л.А., Головенко Н.Я. Пероральный индуктор интерферона "Амиксин" и его аналоги // Журн. АМН Украины. - 1999. - Т.5, №1. - С.53-66.]. _ HC O _ CH3 H3C 3 Cl Cl CH 3 + NH + HN O O Аміксин Але, у низці випадків противірусна та інтерфероніндукуюча активність аміксина є недостатньою. Крім того, при парентеральному введенні аміксин індукує вкрай низькі титри інтерферона, що суттєво звужує область застосування препарату. В основу винаходу поставлено задачу розширення спектра індукторів інтерферону за рахунок створення нових синтетичних низькомолекулярних індукторів. Поставлена задача вирішена синтезом сполук 1-7, що заявляються, загальної формули: R H N N H N O 1-7 де R=C4H10N-діетиламін (1); C5H10N-піперидин-1-іл (2); C4H8NO-морфолін-4-іл (3); C6H12N-4-метилпіперидин-1-іл (4); C4H8N-піролідин-1-іл (5); С6Н12N-азепан-1-іл (6); С5H11N2-4-метилпіперазин-1-іл (7). До сьогодення не сформульовано структурні вимоги до індукторів інтерферону. Крім того, неочевидним у кожному випадку є спектр інтерферонів, що індукуються. Причинно-наслідкові взаємини між структурою об'єктів, що заявляються, і їхньою біологічною дією полягають, очевидно, у здатності інтеркаляторів, що містять залишок амінокислоти, зв'язуватися з опероном гена інтерферону, що повинне приводити до дерепресії гена, його транскрипції і до наступного синтезу інтерферону. Сполуки, що заявляються, одержували алкілуванням вторинних амінів (8-14) метиловим естером монобромооцтової кислоти (15) з наступним гідразинолізом метилових естерів відповідних похідних гліцину (1622). Акридинілювання гідразидів (23-29), що утворювались, яке здійснювали додаванням 9-метокеіакридину (30) до метанольного розчину гідразиду, з послідовними випарюванням реакційної суміші та перекристалізацією залишку з бензолу, приводило до цільових сполук 1-7, чистота яких підтверджена тонкошаровою хроматографією, будова - даними спектроскопії 1Н-ЯМР. O Br R HN CH 3 O R R R 8-14 +30 O N CH3 R O H N N R 16-22 N H N N H 23-29 H3 C O NH 2 O O R N R N 30 Інтерфероніндукуючу активність синтезованих сполук вивчали як описано [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. / За ред. чл.-кор, АМН України О.В. Стефанова. - К:МОЗ, України. ДФЦ, 2001. 392с.] Отримання сполук, що заявляються, підтверджено наступними прикладами. Приклад 1. Отримання діетиламінооцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразиду (1). До розчину 104,5см 3 (1моль) діетиламіну у 500см 3 бензолу додавали при кімнатній температурі та постійному перемішуванні протягом 3г розчин 44см 3 (0,5моль) метилового естеру хлорооцтової кислоти. Суміш кип'ятили 8г, охолоджували до кімнатної температури. Осад, що випав, відфільтровували, промивали на фільтрі бензолом, бензол випарювали у вакуумі. Дистилят розчиняли у 250см 3 метанолу, додавали 30см 3 100%-го гідразингідрату, кип'ятили 2 години, упарювали у вакуумі досуха, додавали 50см 3 води та знову випарювали досуха. Зали шок (гідразид діетиламінооцтової кислоти) висушували у вакуумі (10мм.рт.ст.) при 50°С протягом 24г. До киплячого розчину 7,26г (0,005моль) гідразида діетиламінооцтової кислоти в 100см 3 метанолу додавали за один раз 10,5г (0,05моль) 9-метоксіакридину. Реакційну суміш кип'ятили 30хв., метанол випаровували у вакуумі досуха, залишок розчиняли у 40см 3 теплого бензолу. До отриманого розчину поступово додавали 200см 3 теплого гептану та поволі охолоджували до кімнатної температури. Продукт кристалізувався при потиранні скляною паличкою по стінках склянки. Кристалічний осад відфільтровували, промивали (3х10см 3) на фільтрі охолодженою до - 18°С сумішшю бензола з гептаном (1:5), гептаном (2х10см 3) та висушували у вакуумі. Вихід 12,1г (75%). Знайдено: С(70,58%); Н(6,71%); N(17,45%); C19H22N4О; M.W.322.41; Т.пл. 187°С. Аналогічно була отримана сполука 5. Сполуки 2-4 та 6 отримували аналогічно, з тою лише різницею, що вони кристалізувалися з реакційної суміші та були перекристалізовані з метанолу. Піперидин-1-іл-оцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразид (2). Вихід 83%. Знайдено: С(71,71%); Н(6,72%); N(16,70%); С20H22N4 O; M.W.334.42; Т.пл. 241-242°С. Морфолін-4-іл-оцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразид (3). Вихід 85%. Знайдено: С(67,77%); Н(5,88%); N(16,77%); C19H20N4 O2; M.W.336.40; Т.пл. 253-253,5°С. 4-Метилпіперидин-1-іл-оцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразид (4). Вихід 75%. Знайдено: С(72,34%); Н(6,88%); N(16,15%); C21H24N4O; M.W.348.45; Т.пл. 246-247°С. Піролідин-1-іл-оцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразид (5). Вихід 53%. Знайдено: С(71,10%); Н(6,36%); N(17,36%);C19H20N4O, M.W.320.40; Т.пл. 131-131,5°С. Азепан-1-іл-оцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразид (6). Вихід 70%. Знайдено: С(72,34%); Н(6,88%); N(15,96%); C21H24N4 O; M.W.348.45; Т.пл. 214-214,5°С. 4-Метил-піперазин-1-іл-оцтової кислоти N'-акридин-9-іл-гідразид (7). Вихід 64%. Знайдено: С(68,74%); Н(6,67%); N(19,87%); С20Н23N5O; M.W. 349.44; Т.пл. 249-250°С. Характеристики спектрів 1Н-ЯМР синтезованих сполук наведені в таблиці 1. Приклад 2. Вивчення інтерфероніндукуючих властивостей. Інтерфероніндукуючу активність препаратів вивчали в культурі лейкоцитів донорів. Використано лейкоцити донорської крові 0(І) групи в концентрації 3х106кл/мол. До лейкоцитарної маси концентрації 3х106кл/мол. додавали препарати в концентрації 10мкг/мол, інкубували 24 години при 37°С. Потім у надосадовій рідині визначали активність інтерферону з використанням культури клітин Л41 (лімфоїдні клітини людини) за раніше опублікованою методикою [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації./ За ред. чл.-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К:МОЗ, України. ДФЦ, 2001. - 392с.] (пригнічення цитопатогенної дії вірусу везикулярного стоматиту). Визначення активності інтерферону здійснювали через 24-48год, коли доза внесеного вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) 100 ТЦД50 викликає повну дегенерацію клітин у контролі вірусу (KB) за відсутністю дегенерації у неінфікованій культурі. За титр інтерферону в ОД (одиницях дії) приймали величину, зворотну розведенню препарату, при якому культура клітин в 50% лунок була повністю захищена від цитопатогенної дії індикаторного вірусу. Розрахунок активності інтерферону в МО ведеться за формулою: Х=титр зразка в ОД/мл х (активність СЗ/титр СЗ), де Х - активність інтерферону, індукованого в досліді препаратом, що вивчається, виражена в МО/мл, ОД - титр інтерферону в-дослідній групі, МО - міжнародні одиниці. СЗ - стандартний зразок, чисельник - активність інтерферону - СЗ в МО, яка відома заздалегідь, знаменник - титр інтерферону СЗ, отриманий в даному досліді і виражений в одиницях дії, зворотних до розведення препарату. Титр індукованого інтерферону (максимальне розведення супернатанта, при якому в 50% лунок цілком запобігалася дегенерація клітинного моношара) визначали в трьох рівнобіжних експериментах. Дані про інтерфероніндукуючу активність сполук 1-7 наведені в таблиці 2. Таблиця 1 Характеристики спектрів 1Н-ЯМР синтезованих сполук Сполука Дані спектру 1Н-ЯМР 1 Алі фатич.: т. 1.032м.ч., 7.2Гц (6Н, (CH 3CH2)2N); кв. 2.609м.ч., 7.2Гц (4H, (CH 3CH2)2N); с. 3.246м.ч., (2Н, COCH2N). Ароматич. СН: м. 7.051м.ч., (1Н); м. 7.124м.ч., (1Н); м. 7.212м.ч., (1Н); м. 7.365м.ч., (2Н); м. 7.521м.ч., (1Н); м. 8.177м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.557м.ч., (1Н); д.ш.с. 11.069м.ч., (1Н). 2 Алі фатич.: м. 1.460м.ч., 5.4Гц (2Н, CH2(СH2СН2)2N); м. 1.580-1.670м.ч., 5.4Гц (4Н, CH2(CH2CH2)2N); т. 2.582м.ч., 5.4Гц (4Н, CH2(CH2CH2)2N)); с. 3.177м.ч., (2Н COCH 2N). Ароматич. СН: м. 7.081м.ч., (1Н); м. 7.197м.ч., (1Н); м. 7.248м.ч., (1Н); м. 7.411м.ч., (2Н); м. 7.552м.ч., (1Н); м. 8.204м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.600м.ч., (1Н); д.ш.с. 11.066м.ч., (1Н). 3 Алі фатич.: т. 2.644м.ч., 7.2Гц (4Н, О(CH 2CH2)2N); т. 3.710м.ч., 7.2Гц (4Н, О(CH 2CH2)2N); с. 3.231м.ч., (2Н COCH2N). Ароматич. СН: м. 7.086-7.137м.ч., (1Н); м. 7.163-7.261м.ч., (2Н); м. 7.3747.464м.ч., (2Н); м. 7.535-7.605м.ч., (1Н); м. 8.180-8.250м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.568м.ч., (1Н); д.ш.с. 10.975м.ч., (1Н). 4 Алі фатич.: н/р т. 1.809м.ч., (4Н, (CH 2CH2)2N); н/р т. 2.700м.ч., (4Н, (CH 2CH2)2N), с. 3.350м.ч., (2Н COCH2N). Ароматич. СН: м. 7.035-7.128м.ч., (2Н); м. 7.208-7.235м.ч., (1Н); м. 7.369-7.395м.ч., (2Н); м. 7.486-7.536м.ч., (1Н); м. 8.112-8.210м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.523м.ч., (1Н); д.ш.с. 11.018м.ч., (1Н). 5 Алі фатич.: д. 0.918м.ч., 6.6Гц (3Н, СН3СН(СН2СН2)2N); м. 1.300-1.420м.ч., (1Н, CH3CH(CH2CH2)2N); набор мультиплетов 1.165-1.295м.ч. (2Н), 1.613-1.655 (2Н), 2.168-2.242 (2Н), 6 7 2.752 - 2.861 (2Н) (СН3CH(СН2СН2)2N); с. 3.153м.ч., (2Н, COCH 2N). Ароматич. СН: м. 7.0307.081м.ч., (1Н); м. 7.101-7.151м.ч., (1Н); м. 7.198-7.242м.ч., (1Н); м. 7.378-7.402м.ч., (2Н); м. 7.5017.552м.ч., (1Н); м. 8.148-8.206м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.408м.ч., (1Н); д.ш.с. 11.018м.ч., (1Н). Алі фатич.: набор мультиплетов (CH2CH2CH2)2N) 1.537-1.721м.ч., (6Н); 2.749-2.784м.ч., (4Н): м. 3.315-3.340м.ч., (2Н); с. 3.354м.ч., (2Н, COCH2N). Ароматич. СН: м. 7.075-7.126м.ч., (1Н); м. 7.1547.205м.ч., (1Н); м. 7.229-7.255м.ч., (1Н); м. 7.402-7.451м.ч., (2Н); м. 7.532-7.583м.ч., (1Н); м. 8.2098.260м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.507м.ч., (1Н); д.ш.с. 11.051м.ч., (1Н). Алі фатич.: с. 2.240м.ч., (3Н, CH3N(CH2CH2)2N); н/р м. 2.280-2.500м.ч., (4Н, CH3N(CH2CH2)2N); н/р м. 2.578-2.711м.ч., (4Н, CH3N(CH2CH2)2N); с. 3.207м.ч., (2Н, COCH 2N). Ароматич. СН: м. 7.0637.114м.ч., (1Н); м. 7.175-7.241м.ч., (2Н); м. 7.391-7.445м.ч., (2Н); м. 7.547-7.598м.ч., (1Н); м. 8.1678.206м.ч., (2Н). NH: ш.с. 10.548м.ч., (1Н); ш.с. 10.981м.ч., (1Н). Таблиця 2 Інтерфероніндукуюча активність сполук, що заявляються Сполука 1 2 3 4 Титр інтерферону 1280 20 1280 640 Сполука 5 6 7 Аміксин Титр інтерферону 20 1280 80 320 Як видно з наведених даних, сполуки, що заявляються, є індукторами інтерферону, причому за своєю активністю 3 з них значно перевищують аміксин.