Спосіб отримання естрогенів in vitro

Спосіб отримання естрогенів in vitro, який включає типове синтетичне середовище, клітини гранульованого шару фолікулів, який відрізняється тим, що середовище додатково містить еструсну сироватку корів, фолікулярну рідину і гепарин з подальшим культивуванням 30-32 доби із заміною через 14-16 діб 2/3 об'єму середовища культивування. (19) (21) u201010103 (22) 16.08.2010 (24) 10.05.2011 (46) 10.05.2011, Бюл.№ 9, 2011 р. (72) ОСТАПІВ ДМИТРО ДМИТРОВИЧ, САЧКО РОМАН ГРИГОРОВИЧ, МАРТИН ЮРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, АКИМИШИН МАР'ЯНА МИКОЛАЇВНА, ГРАБОВСЬКА ОЛЕКСАНДРА СТЕПАНІВНА, ПИЛИПЕЦЬ АНДРІЙ ЗЕНОВІЙОВИЧ 3 шару фолікулів і внесення в середовище еструсної сироватки корів, фолікулярної рідини і гепарину при такому співвідношенні компонентів (в мас.%): клітин гранульозного шару 5-7 млн. кліфолікулів тин/мл, еструсної сироватки корів 8-12, фолікулярної рідини 10-12, гепарину (5 тис. од.) 0,0005-0,0015, синтетичне середовище RPMI-1640 до 100 %. Клітини гранульозного шару отримують з фолікулів діаметром більше 7 мм і культивують 30 діб, з заміною 2/3 об'єму середовища культивування через 14-16 діб. Ефективність способу ґрунтується на здатності клітин гранульозного шару синтезувати естрогени (естрадіол + прогестерон) у оптимальному співвідношенні для організму самок, а інтенсивність синтезу забезпечується складовими синтетичного середовища RРМІ-1640 (амінокислот, антиоксидантів, мінеральних солей, енергетичних субстратів - глюкози, пірувату, сукцинату) та доданих біологічних компонентів, які забезпечують перебіг фізіологічних процесів в клітинах гранульозного шару й синтез вказаних гормонів. Культура клітин гранульозного шару фолікулів здатна асимілювати неорганічні та органічні компоненти синтетичного середовища і синтезувати естрогени. При такому способі культивування культура клітин гранульозного шару забезпечує отримання комплексу естрогенів (естрадіол + прогестерон) і є простим біотехнологічним способом отримання комплексу гормонів, виготовлення їх лікарських форм і препаратів та використання у практиці ветеринарної медицини для стимулювання репродуктивної функції самок і лікування безпліддя. При проведенні заявником патентноінформаційного пошуку знайдено технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим - використання біологічного способу отримання комплексу гормонів - естрогенів (естрадіолу і прогестерону) при культивуванні клітин гранульозного шару фолікулів яєчників корів (Roberts Aj., Echternkamp S.E. In Vitro Production of Estradiol by Bovine Granulosa Cells: Evaluation of Culture Condition, Stage of Follicular Development and Location of Cells Within Follicles //Biology of Reproduction - 1994. - 51. - P. 273-282).. Однак, даних суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого способу отримання естрогенів in vitro не знайдено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі "новизна". В джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомостей про способи отримання естрогенів, які б містили ознаки, що відрізняють заявлений корисну модель від прототипу: використання клітин гранульозного шару фолікулів у синтетичному середовищі RPMI-1640 з введенням у склад компонентів у такому співвідношенні (в мас.%): 59121 4 клітин гранульозного шару 5-7 млн. кліфолікулів тин/мл, еструсної сироватки корів 8-12 %, фолікулярної рідини 10-12 %, гепарину (5 тис. од.) 0,0005-0,0015, синтетичне середовище RPMI-1640 до 100 %. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого рішення критерію корисної моделі "винахідницький рівень". Корисна модель може бути використаний в фармацевтичній галузі та ветеринарній біотехнології для виготовлення препаратів з вмістом комплексу гормонів (естрадіол + прогестерон) та практиці ветеринарної медицини для лікування й стимулювання репродуктивної функції самок сільськогосподарських тварин і тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим промисловопридатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентної спроможності корисної моделі відповідно до статті 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" (№ 1771-III, 2000 p.). Для реалізації заявленого корисної моделі необхідно отримати клітини гранульозного шару фолікулів яєчників корів. Для цього, після забою корів, відбирають яєчники. Методом аспірації фолікулів отримують фолікулярну рідину з клітинами гранульозного шару. Шляхом центрифугування (1 тис. об. хв. протягом 15 хв.) осаджують клітини гранульози. Надосадову рідину (фолікулярну рідину) відбирають, а до осаду клітин гранульози додають середовище культивування (RPMI1640) у кількості, яка адекватна відібраній фолікулярній рідині. При дотриманні умов антисептики додаткового введення у склад середовища культивування антибіотиків та антимікотиків не доцільно. Після 14-16 добового культивування відбирають 2/3 середовища культивування. У відібраному середовищі культивування містяться продукти синтезу клітин гранульозного шару - гормони: естрадіол - 0,04-2,4 нг/мл і прогестерон - 2,0-69,6 нг/мл. Для оцінювання ефективності заявленого способу отримання естрогенів було проведено досліди конкретного виконання рішення. Дослід 1 На м'ясопереробному підприємстві були відібрані яєчники корів. В умовах лабораторії отримано клітини гранульозного шару з фолікулів і проведено їх культивування впродовж 60 діб. При цьому, для встановлення ефективності заявленого способу клітини гранульози розділені на дві частини. Одна частина культивована у середовищіпрототипі, інша - заявленим способом. Вміст естрогенів (естрадіолу та прогестерону) у фолікулярній рідині (0 доба культивування) та середовищі культивування через 2-3, 7-8, 14-16, 30-32 і 60 діб визначали імуноферментним методом. Встановлено, що при культивуванні клітини гранульози синтезують естрогени і виділяють їх в середовище культивування (табл. 1). Так, у 5 59121 6 Таблиця 1 Інтенсивність синтезу естрогенів клітинами гранульозного шару фолікулів корів. Концентрація естрогенів, мг/мл Гормони 2-3 Тривалість культивування, доби 7-8 14-16 30-32 60 0,16±0,10 3,1±0,63 0,15±0,05 2,7±0,69 0,9±0,47 11,7±9,11 0,9±0,62 4,5±1,84 0,4±0,29 60,8±4,30 0 Естрадіол Прогестерон 1,1±0,18 63,2±3,31 Естрадіол Прогестерон 1,1±0,18 63,2±3,31 Прототип 0,6±0,15 0,3±0,11 6,0±1,53 13,9±7,73 Заявлений спосіб 0,7±0,12 0,4±0,29 8,6±2,36 15,6±7,19 фолікулярній рідині, отриманій при виділенні клітин гранульози, концентрація досліджуваних гормонів максимальна (естрадіолу 1,1±0,18 нг/мл, прогестерону - 63,2±3,31 нг/мл). Через 2-3 доби культивування вміст вказаних гормонів знижується - естрадіолу: у прототипі на 45,5 % і у заявленому способі на 36,4 % і прогестерону, відповідно, 90,6 % і 86,4 %. Збільшення тривалості культивування до 7-8 діб характеризується ще зменшенням концентрацій естрадіолу у прототипі на 50,0 % і у заявленому способі на 42,9 %, порівняно з 2-3 добовим. Після 14-16 діб культивування концентрація естрадіолу у культурі клітин з прототипом продовжує знижуватись на 46,3 % до 0,16±0,10 нг/мл, а у заявленому середовищі, навпаки, зростає на 65,6 % до 0,9±0,47 нг/мл, що майже відповідає вихідній величині (0 доба культивування). Отже, через 14-16 діб концентрація естрадіолу при використанні заявленого на 82,2 % способу вища, ніж у прототипі. При цьому, використання заявленого способу забезпечує підвищення концентрації естрадіолу, який досягає майже вихідного рівня у фолікулярній рідині (0 доба культивування). Концентрація прогестерону протягом 7-16 діб при використанні заявленого способу майже не змінюється і становить 11,7-15,6 нг/мл, а у прототипі - знижується на 50,0 % і на 14-16 добу становить 3,1±0,63 нг/мл, що на 83,6 % нижче величини значення при заявленому способі. Продовження до 30-32 діб культивування заявленим способом концентрація естрадіолу у сере довищі культивування клітин майже не змінюється і становить 0,9±0,62 нг/мл, а прогестерону - знижується на 71,6 % до 4,5±1,84 нг/мл, у прототипі концентрація досліджуваних гормонів не змінюється і становить, відповідно, 0,15±0,05 і 2,7±0,69 нг/мл. Ще через 30 діб (60 діб від початку культивування) при використанні заявленого способу отримання естрогенів концентрація естрадіолу знижується на 55,6 %, а прогестерону, навпаки, зростає на 92,6 %. Отже, при використанні заявленого способу отримання естрогенів клітини гранульози доцільно культивувати 30 діб у середовищі RPMI-1640, з заміною 2/3 об'єму середовища через 14-16 діб, що забезпечує стабільну їх естроген-синтезуючу здатність. Дослід 2 З метою отримання максимальної концентрації естрогенів вивчили залежність між тривалістю культивування та синтезом гормонів гранульозою в залежності від розміру фолікулів. Для цього на м'ясопереробному підприємстві були відібрані яєчники корів. В умовах лабораторії отримано клітини гранульозного шару з фолікулів діаметром менше 7 мм та більше 7 мм і проведено їх роздільне культивування впродовж 60 діб з використанням заявленого способу отримання естрогенів. Дослідженнями встановлено, що інтенсивність синтезу естрадіолу найвища у фолікулах діаметром більше 7 мм (табл. 2). Так, концентрація досліджуваних гормонів у фолікулярній рідині, після вилучення клітин Таблиця 2 Інтенсивність синтезу естрогенів культурою клітин гранульози в залежності від розміру фолікула Гормони Естрадіол Прогестерон Розмір фолікула, мм 77 77 0 1,1±0,22 1,3±0,11 62,5±3,89 67,1±3,02 Концентрація естрогенів, нг/мл Тривалість культивування, доби 2-3 7-8 14-16 0,6±0,14 0,6±0,40 0,3±0,02 0,9±0,18 1,1±0,39 2,3±0,75 7,2±1,69 18,7±10,08 2,0±0,71 12,0±6,32 9,3±2,10 5,0±1,15 30-32 0,2±0,04 2,4±0,62 5,2±2,58 2,9±1,24 60 0,1±0,03 1,1±0,49 56,3±3,50 69,6±5,23 7 59121 гранульози, не залежно від розміру фолікула була майже однакова (0 доба). Через 2-3 доби культивування гранульоза з фолікулів більше 7 мм синтезує естрадіолу менше на 30,8 %, порівняно з 0 днем (фолікулярною рідиною). На 7-8 доби культивування клітини підвищують інтенсивність синтезу гормону на 22,2 %, а на 14-16 доби його концентрація подвоюється і становить 2,3±0,75 нг/мл. Рівень інтенсивності синтезу естрадіолу клітинами гранульози фолікулів з діаметром більше 7 мм утримується впродовж 30-32 діб. На 60 добу досліджень інтенсивність утворення естрогену знижується до 1,1±0,49 нг/мл. На відміну від клітин фолікулів діаметром більше 7 мм, гранульоза фолікулів менше 7 мм через 2-3 доби культивування синтезує естрадіолу менше на 45,5 %, 14-16 діб - на 72,8 %, 30-32 доби - на 81,9 % та через 60 діб - на 90,1 %, порівняно з його концентрацією у фолікулярній рідині (0 доба). Отже, для забезпечення максимального син Комп’ютерна верстка А. Крулевський 8 тезу та отримання високої концентрації естрадіолу у середовищі культивування необхідно відбирати клітини гранульози з фолікулів діаметром більше 7 мм та культивувати впродовж 30-32 діб, із заміною 2/3 об'єму середовища культивування через 14-16 діб. Концентрація прогестерону у фолікулярній рідині (0 доба) не залежно від розміру фолікулів в межах 62,5-67,1 нг/мл, через 2-3 доби культивування клітини з фолікулів діаметром менше 7 мм знизили синтез гормону на 88,5 % та з фолікулів розміром більше 7 мм - на 82,2 %, вміст якого на 78 доби вірогідно не змінюється і залишається на рівні 2-3 діб. На 14-32 доби культивування концентрація прогестерону, не залежно від розміру фолікулів, знаходиться в межах 2,0-5,2 нг/мл, а на 60 добу культивування, зростає, у гранульозі з фолікулів менше 7 мм - на 90,8 % та з фолікулів більше 7 мм - на 95,9 %. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601