Склад кріоконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової крові (варіанти)

1 Склад крюконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової крові, що передбачає застосування водного розчину хлориду натрію, цукрів та крюпротектора, який відрізняється тим, що як цукри він містить ПОЛІГЛЮКІН, як крюпротектор - димексид та додатково лізоцим у співвідношенні компонентів розчину, об % Склад крюконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової крови, його варіанти Винахід відноситься до біологи та медицині і може бути використаний для крюконсервування гемопоетичних клітин донорської кордової крови людини Відомий склад крюконсерванту (дивись спосіб консервації еритроцитів, патент Роси №2051580, МПК А01 N1/02, А61 К35/18, дата публікації 1996 01 10) який передбачає використання для крюконсервування водного розчину пропиленгліколю, сахарози та хлористого натрію у бідистильованій води Крюконсервант такого складу має обмежену сферу застосування і може використовуватися лише для заморожування клітин, які не мають ядра (як еритроцити) Такий крюконсервант передбачає застосування великої швидкості заморожування і не може застосовуватися для клітин, що мають ядра і консервуються з низькою швидкість охолодження бо обезвожує клітину Відомий склад крюконсерванту (дивись Спосіб крюконсервування кровотворних клітин кордової крові, патент України №31847 МПК 6 А01 N1/02 А, дата публікації 15 12 2000, номер бюлетеня 7) 40-45 8-9 ЛІЗОЦИМ 0,04-0,05 димексид 4-6 вода бідистильована решта 2 Склад крюконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової крові, що передбачає застосування водного розчину хлориду натрію, цукрів та крюпротектора, який відрізняється тим, що як цукри він містить ПОЛІГЛЮКІН, як крюпротектор поліетиленоксид м м 400 та додатково лізоцим у співвідношенні компонентів розчину, об % ПОЛІГЛЮКІН 6%, рН 4,5-6,0 хлорид натрію ПОЛІГЛЮКІН 6%, рН 4,5-6,0 40-45 хлорид натрію лізоцим поліетиленоксид м м 400 вода бідистильована 8-9 0,04-0,05 10-20 решта який передбачає використання для крюконсервування гемопоетичних клітин кордової крови людини водного розчину Декстрану-60 (декстрану молекулярної маси 60000) в концентрації 1,2% Крюконсервант такого спрощеного складу не може забезпечити збереження життєздатності клітин при крюконсервуванні тому, що він не зв'язує необхідну КІЛЬКІСТЬ води і не забезпечує необхідну структуру льоду, великі кристали якого пошкоджують мембрани клітин Відомий склад крюконсерванту (дивись Спосіб крюконсервування та підготовки до трансфузії гемопоетичних клітин кордової крові, патент України №30014 МПК А01 N1/02, А61 К35/14, дата публікації 15 11 2000, номер бюлетеня 6) який передбачає використання для крюконсервування гемопоетичних клітин кордової крови людини водного розчину низькомолекулярного полівшілпіролідону, глюкози та лактози у співвідношенні компонентів розчину об % низькомолекулярний полівшілпіролідон 17-20 глюкоза 10-11 лактоза 4-5 вода до 100 00 со сч о (О 60238 При цьому як сольовий розчин полівшілпіроліу якості сахарив він містить полиглюкин, у якості дону використовують водний розчин низькомолекрюпротектора полиетиленоксид м м 400 та додакулярного полівшілпіролідону, натрію хлориду, тково лизоцим у співвідношенні компонентів розкалію хлориду, кальцію хлориду, магнію хлориду, чину об % натрію гідрокарбонату у співвідношенні об % поліглюкин 6% рН4,5-6,0 40-45 низькомолекулярний хлорид натрію 8-9 полівшілпіролідон 6-6,5 лізоцим 0,04-0,05 натрію хлорид 0,50-0,55 полиетиленоксид м м 400 10-20 калію хлорид 0,04-0,045 вода бідистільована решта кальцію хлорид 0,05-0,001 Проведені досліди показують, що успіх крюконсервування визначається не тільки оптима0,0005льною технологією заморожування, а також скламагнію хлорид 0,001 дом речовин оточення в якому охолоджується об'натрію гідрокарбонату 0,023-0,025 єкт вода до 100 (Точно такий склад кр і о консерванту передбаСклад запропонованого крюконсерванту зачено також у патенті України №42599 МПК А01 безпечує оптимальну проникність крюпротектору у N1/00, А01 N1/02 В, А61 К35/14, дата публікації клітину в зв'язку з чим забезпечується достатній 15 10 2001, номер бюлетеня 9) захист внутрікліткових компонентів Використання низькомолекулярних сахарів у Хлорид натрію, у запропонованої КІЛЬКОСТІ заскладі крюконсерванту призводить до певних пробезпечує підтримання допустимих границь колиблем Низькомолекулярні сахари мають можвання осмотичного тиску у нутрі та поза клітинами ливість проникати через кліткову мембрану у Дія хлористого натрію складається в зниженні клітини і при розморожуванні, внаслідок градієнту осмотичного тису при переході вирівнювання градієнту концентрації позакліткова крюпротектора з середи в клітину и в зворотному вода буде проникати у клітку Внаслідок перевинапрямку, що запобігає розриву плазматичної щення КІЛЬКОСТІ води усередині КЛІТИНІ її мембрана мембрани в процесі заморожування - відігріва може пошкоджуватися Наявність полиглюкину забезпечує норТакий крюконсервант передбачає застосуванмалізацію осмотичного градієнту в системі ня в своєму складі великої різноманітності та КІЛЬЛізоцим В складі крюконсерванту володіє бакКОСТІ СІЛІ Перевищення різноманітності та КІЛЬКОСТІ териолитичною дією, здатністю стимулювати неСІЛІ в розчині один з механізмів пошкодження кліспецифічну реактивність організму, оказувати протин при замороженні Внаслідок заморожування, в тивозапальну і муколитичну дію Крім того, його просторі між кристалами льоду (тобто в присутність в розчині стимулює проліферацію міжклітинному просторі) їх концентрація стволових клітин кордової крови підвищується Це призводить до кризи клітин, які з Для забезпечення корекції концентрації воднаходяться у цьому просторі невих и гідроксильних ІОНІВ та для підтримання стабільності рН середи в складі крюпротектору Полівшілпіролідон, внаслідок його низької додатково може бути застосований фосфатній проникності у клітину менш ефективний крюпротебуфер ктор і ВІДПОВІДНО не забезпечує достатнього захисту внутрікліткових компонентів Сутність винаходів що заявляються пояснюється прикладами Компоненти, використовувані Завданням винаходу є створення складу крюпри виготовленні крюконсерванту для гемопоетиконсерванту для гемопоетичних клітин донорської чних клітин донорської кордової крови що заявлякордової крови у якому шляхом зміни знайдених ється, фармакопейної якості і випускаються проемпіричним шляхом інгредієнтів, та їх вмісту в мисловим шляхом складі крюконсерванту, забезпечується покращання умів збереження клітин донорської кордової Лізоцим (Lysocim) - фермент білкової прирокрови, збільшення періоду збереження та підвиди, молекулярна маса 15000, форма випуску в щення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин кордової крогерметично закоркованих флаконах по 15, 100 і ви після періоду збереження 150мг Для вирішення цього завдання крюконсервант Розчин полиетіленоксіда - 400 30% (Solutio для гемопоетичних клітин донорської кордової Polyaethylenoxydi - 400, 30%) Форма випуску в крови передбачає застосування в своєму складі скляних пляшка для препаратів крові та крововодного розчину Хлориду натрію, сахарив та крюзамінників по 100, 250, 500мл) п роте кто pa Дімексід (Dimexidum) Концентрат містить 99,0% діметілсульфоксіду концентрат випускають Новим у складі крюконсерванту є те, що у яков скляних пляшках оранжевого кольору по 100мл сті сахарив він містить полиглюкин, у якості крюпротектора димексид та додатково лизоцим у Полиглюкін (Реополіглюкин) 6% розчин, форспіввідношенні компонентів розчину об % ма випуску в скляних пляшках 250 и 500мл поліглюкин 6% рН4,5-6,0 40-45 У Таблиці 1 дані приклади конкретного викохлорид натрію 8-9 нання варіантів здійснення складу крюконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової лізоцим 0,04-0,05 крови з зазначенням застосовуваних речовин, а в дімексид 4-6 таблиці 2 ЯКІСНІ характеристики, що досягаються вода бідістільована решта при застосуванні крюконсервантів одержуваних у В іншому варіанті виконання крюконсерцих прикладах ванта для гемопоетичних клітин донорської кордової крови, новим у складі крюконсерванту є те, що 60238 Спосіб готування кріоконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової крови в зазначених прикладах здійснювали таким шляхом Склад кріоконсерванту готували за добу де проведення досліджень При приготуванні зазначеного в таблиці 1 складу спочатку готували розчин хлориду натрію, перемішували шляхом похитування або на магнітній мішалці колби протягом 5 хвилин Потім додавали наступний компонент і також перемішували протягом 5 хвилин Компоненти додавали в такій ПОСЛІДОВНОСТІ Після розчинення хлориду натрію розчиняли решту солей, потім ВІДПОВІДНИЙ до прикладу крюпртотектор, цукру та лізоцим Підготовка клітин до низькотемпературного консервування В отриману завісь клітин, що призначені для крюконсервування, через ін'єкційну голку по краплині додавали такий же об'єм крюконсерванта ВІДПОВІДНО прикладу, при легкому перемішуванні завісі шляхом похитування пробірки В камері Горяєва підраховували КІЛЬКІСТЬ ядерних клітин в препараті За допомогою шприцу через ін'єкційну голку клітини розливали по 1мл в поліетиленові крюампули об'ємом 1-1,8мл фірми Nunc (CryoStore Boxes) Крюампули герметично зачиняли кришками і маркували Заморожування гемопоетичних клітин виконували за допомогою програмного заморожувача, який дозволяє варіювати швидкість зниження температури на різних етапах крюконсервування і автоматично здійснювати ініціювання процесу кристалізації (СІДІНГ) за певної температури Заморожування здійснювали в три етапи, при цьому на першому етапі з швидкістю 0,7-1,2°С за 1хв от +20°С до до -8,5-10,5°С, на другому етапі зі швидкістю 1,0-4,5°Схв до -ЗО - -40°С, температурною зупинкою при - 25-30°С 3-5 хв , а на третьому етапі зі швидкістю 10-12°С/хв до -130-196°С Розморожування сателіта стерильних і чистих від вірусної і мікоплазмової флори зразків для культивування Стерильні та чисті від вірусної і мікоплазмової флори зразки досліджували на біологічну активність методом культивування в напівтвердих се редовищах, для (розведення в підрахунку КІЛЬКОСТІ КЛІТИН КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН попередників та їх проліферативної активності Розморожування сателіту, призначеного для культивування, виконували таким чином сателіт вилучали із низькотемпературного банку і розміщували у водяну баню (плюс 40±0,5°С) на 50-60 сек до появлення рідкої фази (в контейнері плаває крижинка), переносили в лабораторію для культивування Контейнер обробляли стерилізуючим розчином і вносили в камеру ламінарного боксу для подальшої роботи Підрахунок КІЛЬКОСТІ розморожених гемопоетичних КЛІТИН Стерильним одноразовим Юмл шприцом через ін'єкційну голку клітини переміщували в контейнері і 2 краплини наносили на предметне скло, з яких набирали меланжер до першої позначки, а з клітин, що залишились, робили мазки В меланжер добирали до кінцевої позначки розчин метиленового синього на 2%-му розчині оцтової кислоти 10 разів) підраховували в камері Горяєва під мікроскопом Визначення КІЛЬКОСТІ клітин-попередників (КОЕ-ГМ) в розморожених зразках гемопоетичних клітин Визначення КОЕ-ГМ в зразках розморожених гемопоетичних клітин виконують шляхом культивування в напівтвердому агарі протягом 7-9 днів за методикою Пайк і Робінсон, 1970 р з модифікацією, що описана в монографії «Гемопоетичні клітини ембріональної печінки людини (ембріогенез, трансплантація, крюконсервування)», В І Грищенко, Г С Лобинцева , І А Вотякова, С І Шерешков Київ, 1988 Підрахунок КІЛЬКОСТІ колоній і кластерів здійснювався на постійних препаратах під мікроскопом Життєздатність розморожених клітин, оцінених за методом тонування, у порівнянні з нативними клітинами не повинна бути менше, ніж 60% Як видно з результатів ДОСЛІДІВ, запропонований склад кріоконсерванту для гемопоетичних клітин донорської кордової крови забезпечує високе збереження клітин-попередниць гемопоеза кордової крови в порівнянні з аналогічними складами кріоконсерванту Таблиця 1 Натрію гідрокарбонат Магнію хлорид Кальцію хлорид 40 45 41 45 Калію хлорид 0,05 0,05 0,04 0,04 Лактоза 0 0 0 0 Глюкоза 4,8 5 6 4 Низькомолекулярний олівінілпіролідон ПОЛІГЛЮКІН 42 Лізоцим 0,5 8,3 8,9 8,2 9 Поліетиленоксид 66,9 46,9 41,1 44,8 Димексин 1 2 3 4 Натрію хлоридхлорид прот Вода бідитилбована Прикклади Склад крюконверванту 60238 Продовження таблиці 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 42,8 43 41,3 45 41,5 45,5 41 43,8 32,1 36,4 37 38,2 32,8 34 33,3 31 26,7 34,6 32,5 32 8,8 8,6 8,1 8,4 8,5 8,7 9 8 8,9 8,6 8 8,8 8,2 9 8,7 8 8,3 8,4 8,5 9 4,4 5,4 5,6 4,6 6 5,8 6 5,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 12 10 11 15 17 18 20 20 13 16 15 0,05 0,04 0,04 0,05 0,05 0,04 0,04 0,05 0,05 0,04 0,05 0,04 0,05 0,04 0,05 0,05 0,04 0,04 0,05 0,04 44 43 45 42 44 40 44 43 45 43 45 42 44 40 40 41 45 44 43 44 Таблиця 2 Приклади 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 % живих клітин 82,2±3,2 95,2±2,4 96,1 ±3,1 94,5±2,7 96,2±2,7 93,7±1,8 90,0±3,4 95,4±1,6 96,4±2,9 93,3,1±2,3 94,2±3,4 95,2±2,3 88,7±4,8 90,3±2,1 85,3±2,0 84,1±3,4 87,2±3,4 88,6±1,2 91,2±5,1 90,8±3,7 89,0±3,5 88,4±3,0 87,2±4,2 85,2±3,1 Комп'ютерна верстка В Рябиця Показники КІЛЬКІСТЬ колоній та кластерів на 10 клітин в агарі 86,4±5,8 121,3±2,1 124,2±4,1 123,2±3,0 120,4±4,3 125,7±2,8 121,5±4,2 123,0±3,1 128,0±1,8 121,4±3,3 120,3±3,7 126,5±4,0 110,4±5,2 107,6±3,2 104,7±2,5 102,7±5,3 115,3±2,7 110,6±3,0 121,4±2,1 120,5±1,1 118,8±3,2 116,2+1,1 117,0±3,5 114,5±1,2 Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна