Рекомбінантний модифікований генно-інженерний поліпептид hccore-25, що імітує структурний білок нуклеокапсиду вірусу гепатиту с

1. Рекомбінантний білок НСсоrе-25, продукований бактеріями Е.соlі, що імітує структурний білок нуклеокапсиду вірусу гепатиту С генотипу 1b, який містить послідовності олігогістидинового пеп 3 60424 4 який містить тільки імунодомінантні області р22 субтипу, поширеного на території України, і синтезується у вигляді поліпептиду з олігогістидиновою послідовністю для хроматографічного очищення. На даний час генно-інженерні технології дозволяють клонувати гени вірусів і забезпечувати їх ефективну бактеріальну експресію. Оптимізовані протоколи виділення з бактеріальної культури та очистки білку, дозволяють отримувати його в препаративних кількостях, достатніх для масштабного виробництва діагностичних наборів, подальшої імунізації тварин, продукування специфічних моноклональних антитіл. Однак, рекомбінантних аналогів білку р22 генотипу 1b, які містять тільки імунодомінантні області та олігогістидиновий тег для хроматографічного очищення, одержаних синтезом у бактеріях Е.соlі, на сьогодні не створено. Вирішення поставленого завдання проводи лось за наступною схемою: визначення розміщення імунодомінантних ділянок в послідовності антигену р22, розробка способу отримання цільової ДНК з РНК вірусу, вбудовування нуклеотидної послідовності в плазмідний вектор для експресії в бактеріях, оптимізація протоколу напрацювання рекомбінантного білка в достатніх кількостях. Поставлена задача вирішується пропонованим модифікованим генно-інженерним рекомбінантним білком НСcore-25, продукованим бактеріями Е.соlі, який імітує антиген нуклеокапсиду вірусу гепатиту С. Рекомбінантний білок НСcore-25, продукований бактеріями Е.coli, що імітує структурний білок нуклеокапсиду вірусу гепатиту С генотипу 1b, містить послідовності олігогістидинового пептиду (His)6, складається зі 167 амінокислотних залишків (а.з.), має молекулярну масу 18,7 кДа, ізоелектричну точку РІ 12,04: Рекомбінантний білок НСcore-25 містить імунодомінантні області білку нуклеокапсиду вірусу гепатиту С, що відповідають амінокислотам 1-125. Рекомбінантний білок включає тільки імунодомінантні області білка-попередника. Дана послідовність, клонована у вектор для бактеріальної експресії, дає рекомбінантний продукт НСcore-25, який додатково містить послідовності олігонуклеотидного пептиду формулою (His)6, складається із 167 а.з., має молекулярну масу 18.7 кДа, ізоелектричну точку РІ 12,04 (нуклеотидна послідовність наведена на Фіг.1). Приклад 1. Отримання фрагменту для клонування НСcore-25. Даний приклад описує отримання ДНК, що кодує НСcore генотипу 1b. Виділення тотальної РНК та одержання кДНК. Виділення тотальної РНК з крові хворих на гепатит С проводили з використанням комерційного набору для виділення РНК/ДНК з клінічного матеріалу «РИБО-сорб» АмплиСенс (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Російська Федерація) і рекомендованих виробником протоколів. З виділеної РНК за допомогою реакції зворотної транскрипції отримували кДНК цільового продукту з використанням набору реагентів для отримання кДНК на матриці РНК «PEBEPTA-L» АмплиСенс (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Російська Федерація) та протоколів виробника. Одержання дволанцюгової ДНК. Розробку пар олігонуклеотидів для отримання цільового продукту для клонування проводили з використанням повних та часткових геномних послідовностей РНК та кДНК для вірусу гепатиту С субтипу 1b, які є загальнодоступними з банків генів Національного Центру Біотехнологічної Інформації США (NCBI, accessing number AF176573), а також з бази даних послідовностей гепатиту С Національного Інституту Алергій та Інфекційних Захворювань (США) (NIAID, accessing numbers AY070174, AY587844). За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з вкладеною парою праймерів, одержували дволанцюгову ДНК, що кодує рекомбінантний білок НСcore. Для цього готували наступну суміш: 10 мкл 2х HotStarTaq Master Mix Kit( Qiagen, Німеччина), 1 мкл кДНК, 1 мкл (20 uM) праймер 1,1 мкл (uМ) праймер 2, стерильна деіонізована вода до загального об'єму 20 мкл. Для ампліфікації використовували термоциклер, що програмується. ПЛР проводили за наступних умов: попередня денатурація - 95 °С - 1 хв, денатурація - 95 °С - 45 сек., аннілінг праймерів - 70 °С - 45 сек., елонгація - 72 °С - 45 сек. (3 цикли); денатурація - 95 °С - 45 сек., аннілінг праймерів - 68 °С - 45 сек., елонгація - 72 °С - 45 сек. (3 цикли); денатурація - 95 °С - 45 сек., аннілінг праймерів - 66 °С - 45 сек., елонгація - 72 °С - 45 сек. (3 цикли); денатурація - 95 °С - 45 сек., аннілінг праймерів - 64°С - 45 сек., елонгація - 72 °С - 45 сек. (25 циклів). По завершенню інкубували 5 хв. при 72 °С. Продукт ампліфікації реампліфікували з другою парою праймерів. Для цього готували наступну суміш: 25 мкл 2х HotStarTaq Master Mix Kit (Qiagen, Німеччина), 1 мкл ДНК (отриманої в першому раунді), 2мкл (20uМ) праймер 3,2 мкл (20uМ) праймер 4, стерильна деіонізована вода до загального об'єму 50 мкл. ПЛР проводили за наступних умов: попередня денатурація - 95 °С - 1 хв, денатурація - 95 °С - 1 хв., аннілінг праймерів 50 °С - 1 хв., елонгація - 72 °С - 45 сек. (40 циклів), по завершенню інкубували 5 хв. при 72 °С. Продукт ампліфікації виявлявся електрофорезом в 1 %-ному агарозному гелі з бромистим етидієм з 5 подальшою візуалізацією при 312 нм у вигляді дискретного фрагменту розміром приблизно 400 п.н. Приклад 2. Дослідження специфічної активності рекомбінантного білку НСcore-25 субтипу 1b. Вивчення специфічної антигенної активності проводили методом імуноферментного аналізу. Антигени сорбували в лунках 96-лункових полістиролових планшетів (NUNC, Данія) в концентрації 1 мкг/мл в 50 мМ карбонатно-бікарбонатному буфері (рН 9,6), інкубували при температурі +4 °С протягом ночі, блокували вільні місця планшету буфером з казеїном. Процедура аналізу: в лунки вносили досліджувані сироватки у розведенні 1:2 з буфером для розведення (50мМ Tris-HCl (рН 7,2), 150 мM NaCl, 0.5 % Tw20, казеїн) об'ємом 120 мкл. Інкубували планшет протягом 1 год при температурі +37 °С. Промивали лунки 0,3 мл буфера для промивання (фосфатно-сольовий буфер з Tw20) 5 разів. Вносили 100 мкл кон'югату моноклональних антитіл до IgG людини, зшитих з пероксидазою хрону у титрі 1/10 000, розведених у буфері для розведення. Інкубували планшет при температурі +37 °С протягом 30 хв. Промивали лунки як описано вище. Вносили 100 мкл хромогену (тетраметиленбензидин) в фосфатно-цитратному буфері з Н2О2. Інкубували в темному місці при кімнатній температурі протягом 30 хв. Вносили в лунки по 100 мкл 0,5М Н2SO4 для припинення реакції. Вимірювання оптичної густини (ОГ) проб проводили з використанням спектрофотометра при довжинах хвиль 450/620 нм. Показник граничного значення 60424 6 (cut-off) розраховували, додаючи до середнього значення ОГ негативних контролів (сироваток здорових пацієнтів) величину 0,20. Показники ОГ досліджуваних сироваток, які були нижчими за показник cut-off визначали як негативні. Показники ОГ досліджуваних сироваток, які були вищими чи дорівнювали cut-off визначали як позитивні. Діагностичні характеристики такого тесту перевіряли на зразках сироваток оціночної панелі «Anti-HCV Mixed Titer Performance Panel PHV206» (ВВІ Diagnostics, США). Показано повну відповідність отриманих результатів для НСcore-25 з даними рекомбінантного імуноблоту, зазначеного в паспорті до вказаної панелі. Отриманий рекомбінантний білок дозволяє виявляти антитіла з достатньою чутливістю та специфічністю (Фіг.2). Показано, що пропонований нами рекомбінантний білок дозволяє визначати наявність антитіл, специфічних до білку р22 інших генотипів вірусу гепатиту С, та є придатним для практичного використання. Це перевірено методом ІФА (процедура описана вище) з використанням стандартної панелі генотипованих сироваток ОСО 42-28-310-02П (МБС, Російська Федерація), які містять і не містять антитіла до вірусу гепатиту С генотипів 1b, 2а, 3а. Пропонована корисна модель вирішує проблеми відомого рівня техніки і забезпечує джерело рекомбінантного білка, який містить антигенні детермінанти, достатні для повної імітації активності природного аналога. 7 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 60424 8 Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601