Живильне середовище для культивування m.paratuberculosis

Живильне середовище для культивування M.paratuberculosis, що містить L-аспарагін, калій фосфорнокислий 1-заміщений, сульфат магнію, гліцерин, малахітовий зелений та дистильовану воду, яке відрізняється тим, що додатково містить нікотинову кислоту, лимонну кислоту, лимоннокисле аміачне залізо, піруват натрію, картопля 3 вини природного походження, як курячі яйця, м'ясний екстракт, сироватка великої рогатої худоби або гідролізат казеїну, вилучення цих компонентів не забезпечує ростових властивостей середовища. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити живильне середовище для культивування M.paratuberculosis, що містить L-аспарагін, калій фосфорнокислий 1-заміщений, сульфат магнію, гліцерин, малахітовий зелений та дистильовану воду шляхом вилучення імпортного mycobactin J, яєчної маси та додаткового введення нікотинової кислоти, лимонної кислоти, лимоннокислого аміачного заліза, пірувату натрію, картопляного екстракту - як факторів росту та агару Діфко, при наступному співвідношенні компонентів г/л: L-аспарагін 1,0 - 3,0 Калій фосфорнокислий 1 - заміщений 0,2-0,3 Сульфат магнію 0,2-0,3 Гліцерин 29,0-31,0 Малахітовий зелений 2 % водний розчин 0,5- 1,0 Лимонна кислота 0,5- 1,5 Лимоннокисле аміачне залізо 0,02 - 0,03 Піруват натрію 0,4- 0,6 Нікотинова кислота 0,005 - 0,02 Картопляний екстракт 495,0-510,0 Агар Діфко 25,0- 35,0 Вода дистильована рН 5,5-6,0 до 1000,0. Порівняльний аналіз запропонованого живильного середовища з прототипом дозволяє зробити висновок, що заявлений склад живильного середовища відрізняється введенням до його складу нових компонентів, які придають живильному середовищу високі ростові властивості, дозволяють раніше виявити ріст колоній та забезпечують більше накопичення бактеріальної маси, що відповідає критерію «новизна». Живильне середовище готують таким чином: 3 В колбу ємкістю один літр наливають 400,0 см дистильованої води, підігрівають до 40-45 °С. У вказаній послідовності у воді розчиняють такі компоненти: (г) лимоннокисле аміачне залізо, Lаспарагін, калій фосфорнокислий 1-заміщений, сульфат магнію, лимонну кислоту, піруват натрію, нікотинову кислоту, гліцерин, агар Діфко. Об'єм суміші доводять дистильованою водою до 500,0 3 см , додають рівну кількість стерильного картоп3 ляного екстракту (500,0 см ) та 2 % водного розчину малахітового зеленого. Охолоджують до кімнатної температури і 5 % розчином NaOH доводять рН до 5,5 - 6,0. Розливають в бактеріологічні про3 бірки по 5 см і закривають ватно-марлевими пробками. Після чого середовище стерилізують за температури 120 °С протягом 15 хвилин. Виготовлене середовище викладають на скошені штативи, охолоджують до застигання агару і зберігають за температури 4 °С не більше 10 діб. Перед висівом тест-культури M.paratuberculosis на живильне середовище його перевіряють на стерильність шляхом витримування в термостаті за температури (37,5+0,5) °С протягом трьох діб. 60423 4 Приклад № 1. Живильне середовище готують як вказано вище, при наступному співвідношенні компонентів г/л. L-аспарагін 1,0 Калій фосфорнокислий 1заміщений 0,2 Сульфат магнію 0,2 Лимонна кислота 0,5 Лимоннокисле аміачне залізо 0,02 Піруват натрію 0,4 Нікотинова кислота 0,005 Картопляний екстракт 495,0 Агар Діфко 25,0 Малахітовий зелений 2% водний розчин 0,5 Вода дистильована рН 5,5-6,0 до 1000,0. Приклад № 2. Теж, що і в прикладі № 1 при наступному співвідношенні компонентів г/л. L-аспараін 2,0 Калійфосфорнокислий 1 заміщений 0,25 Сульфат магнію 0,25 Лимонна кислота 1,0 Лимоннокисле аміачне залізо 0,025 Піруватнатрію 0,5 Гліцерин 30,0 Нікотинова кислота 0,01 Картопляний екстракт 500,0 Агар Діфко 30,0 Малахітовий зелений 2 % водний розчин 0,9 Вода дистильована рН 5,5-6,0 до 1000,0. Приклад № 3. Теж, що і в прикладі № 1 та № 2 при слідуючому співвідношенні компонентів г/л. L-аспарапн 3,0 Калій фосфорнокислий 1 заміщений 0,3 Сульфатмагнію 0,3 Лимонна кислота 1,5 Лимоннокисле аміачне залізо 0,03 Піруват натрію 0,6 Гліцерин 31,0 Нікотинова кислота 0,02 Картопляний екстракт 510,0 АгарДіфко 35,0 Малахітовий зелений 2% водний розчин 1,0 Вода дистильована рН 5,5-6,0 до 1000,0. Елективні властивості живильного середовища визначають за часом появи перших колоній, швидкості та інтенсивності росту. Швидкість (доб.) та інтенсивність (+) росту M.paratuberculosis на середовищі, що заявляється і середовищі Левенштейна-Ієнсена з мікобактином наведені в таблиці. Примітка: - росту колоній немає; + - від 1 до 10 колоній; ++ - від 10 до 20 колоній; +++ - від 20 до 50 колоній; ++++ - ріст по всій поверхні середовища. З матеріалів таблиці видно, що на запропонованому середовищі з оптимальним (приклад № 2) та максимальним (приклад №3) вмістом компонентів ріст перших колоній M.paratuberculosis спостерігали на 15 добу. Колоній на середовищах (приклади № 2 і № 3) було не багато (від 1 до 3), однак на 30 добу вони розросталися по поверхні 5 60423 середовища у вигляді великих, зморщених, бугристих колоній, що забезпечує велике накопичення бактеріальної маси. На середовищі з мінімальних вмістом компонентів (приклад №1) та на середовищі Левенштейна-Ієнсена з мікобактином ріст перших одиничних колоній спостерігали на 20 добу. На 30 добу на середовищі (приклад №1) ріст M.paratuberculosis був не стабільним, колонії були малі та дрібні. На середовищі Левенштейна 6 Ієнсена з мікобактином на 30 добу колонії розросталися по поверхні середовища, однак були дрібними у вигляді зморщеного нальоту. Таким чином, запропоноване живильне середовище (приклад №2) є оптимальним для культивування субкультур M.paratuberculosis, має високі елективні ростові властивості, його виготовлення не потребує імпортного mycobactin J, інших дорогих біологічних компонентів. Таблиця Живильне середовище для культивування M.paratuberculosis Запропоноване середовище Приклад №1 (min) Приклад №2 (optim) Приклад №3 (max) Шв.(доб.) Інт-ть росту Шв.(доб.) Інт-ть росту Шв.(доб.) Інт-ть росту росту (+) росту (+) росту (+) 15 15 + 15 + 20 + 20 +++ 20 ++ 30 ++ 30 ++++ 30 +++ Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Середовище Левенштейна-Ієнсена Шв.(доб.) Інт-ть росту росту (+) 15 20 + 30 +++ Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601