Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інжерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини другого типу ( env віл-2)

Винахід відноситься до розділу генної інженерії і може бути використаним в біотехнології і медицині для конструювання тест-систем і наукової праці. Прототипами винаходу є білки ВІЛ, які продукуються E.Coli під контролем плазмідних векторів. (Л.Л. Суханова, В.А. Гольцов, А.Ю. Звонарев и др. Синтез антигенно активных полипептидов вируса СПИД человека типа 1 в бактериальной клетке. // Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии / Под ред. Ф.В. Семенова. - Тарту, 1989, - Т.1. - С.113 - 119), (Y.V.J. Kolbe, F. Jaeger. P. Lepage et al. Isolation of recombinant partial GAG gene product p-18 (HlV-1) from E. Coli // J. Chromatography, 1989, p.99 - 112). Аналогом рекомбінантного білка є структурні білки оболонки віруса імунодефіциту людини другого типу gp110 і gp38, загальною молекулярною масою 67760Д, виділені з нативного вірусу і очищені. В основу завдання покладено завдання створити генно-інженерними методами злитний білок Env-2, який би мав основні імунодомінантні епітопи притаманні нативним білкам gp110 і gp38 ВІЛ-2. Суть винаходу полягає в одержанні під контролем плазмідного експресуючого вектора p32 елітного рекомбінантного білка N-бета-Gal-p110-p38-COOH який має основні імунодомінантні епітопи притаманні нативним білкам gp110 і gp38 ВІЛ-2. Плазмідний вектор p32 розміром 5,2т.п.н., має маркер ампіцилін-резістентності і, після трансформування в E.Coli (штам Y1090), під контролем промотора фага лямбда Pr, забезпечує конститутивний синтез несекретуємого білка, який нагромаджується в цитоплазмі клітин бактерій в пізній логарифмічній, або ранній стаціонарній фазі росту культури. Культивування бактерій проводять при 32 - 39 градусах на середі LB з добавкою ампіциліна (50мкг/мл) на протязі 6 - 8 годин. Після закінчення культивування клітини осаджують центрифугуванням при 8000об/хв. 10 хвилин при 4 градусах, надосадову рідину одкидають, а осад суспендують в TE розчині (0,01M Тріс-HCl, pH 8,0, ЕДТА 0,001М). Суспензію клітин руйнують лізоцимом, ультразвуком, обробляють ДНКазою до зникнення в'язкості розчину, перемішують в емульгаторі 5 хвилин і центрифугують при 12000об/хв. 30 хвилин. Останні дві операції проводять ще 5 раз, кожен раз ресуспендуючи осад в розчині TE. Осад, який являє собою "тільця включення" розчиняють в воді, додають Тріс-HCl до 20мМ, pH 8,01 сечовину до 8 М і інкубують ніч при 4 градуса х для р уйнування "тілець включення" і вилучення з них розчиненого білка Env-1. Подальшу очистк у білка проводять сорбуючи його на ДЕАЕ-целюлозі і елюючи його підвищеними концентраціями NaCl. Кінцевий цільовий продукт являє собою очищений, злитний рекомбінантний білок молекулярною масою 67750Д, який виявляється однією мажорною смугою при електрофорезі в поліакриламідному гелі і в імуноблоті з сироваткою ВІЛ інфікованого пацієнта, містить в собі 1382 амінокислотних залишка, які відповідають нуклеотідним послідовностям бета-галактозідази E.Coli (1 - 609п.н.) і білка ВІЛ (7320 8526п.н.). Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка pEnv- ВІЛ-2, 531 амінокислота. Молекулярна маса рекомбінантного білка 67752Д. Ізоелектрична точка pI = 6,99.