Спосіб інструментального обліку результатів дослідження мікрометодом реакції зв’язування комплементу

Спосіб інструментального обліку результатів дослідження мікрометодом реакції зв'язування 3 Спосіб виконується таким чином. Постановку і облік результатів дослідження мікрометодом РЗК проводять в об'ємі 100 мкл в полістиролових мікроплатах з U-подібним дном за цифровими показниками затримки гемолізу без додаткового центрифугування мікроплат. У лунки мікроплат вносять досліджувані інактивовані сироватки, антиген, попередньо відтитровану дозу комплементу, ставлять відповідні контролі компонентів реакції, витримують мікроплати з компонентами при температурі 37 °С, вносять у всі лунки з досліджуваними і контрольними компонентами індикаторну систему (сенсибілізовані гемолізином еритроцити барана), мікроплати з індикаторною системою витримують на шейкері при 37 °С. Надалі проводять інструментальне визначення цифрової оцінки ступеню затримки гемолізу у лунках плати дослідних і контрольних зразків з визначенням оптичної екстинцієї (ОЕ) на рідері для ІФА, зокрема фірми TECAN, програма Magellan, довжина хвилі   620 нм. Приклад 1. На моделі суспензій нелізованих і лізованих еритроцитів барана досліджена оптична екстинція в залежності від довжини хвилі ( 405; 450; 620 нм) на рідері (спектрофотометрі) фірми Тесап, комп'ютерна програма Magellan. Окремо були виготовлені суспензії 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 % еритроцитів барана на 0,85 %-ому розчині NaCl. Дослідження оптичної екстинції суспензій нелізованих і лізованих еритроцитів проводили у полістиролових мікроплатах 96 лунок з U-подібним дном. Загальний об'єм розчину у лунці 100 мкл. У один ряд лунок вносили по 20 мкл відповідної суспензії еритроцитів барана і 80 мкл 0,85 % розчину NaCl, у другий ряд лунок вносили суспензії еритроцитів відповідних концентрацій по 20 мкл і 80 мкл дистильованої води. Мікроплати з досліджуваними суспензіями струшували 10 хвилин на шейкері фірми ELMI Sky line, 37 °С, 100 об./хв. Візуально було встановлено: у лунках з дистильованою водою - повний лізис суспензії еритроцитів, у лунках із розчином 0,85 % NaCl - суспензія еритроцитів без гемолізу. У подальшому провели інструментальне визначення оптичної екстинції (ОЕ) лізованих і нелізованих суспензій еритроцитів різних концентрацій. Результати досліджень свідчать, що при довжині хвилі 405 нм показник ОЕ в лізованих і нелізованих суспензіях еритроцитів був майже однаковим і зростав в залежності від досліджених концентрацій еритроцитів від 0,6 до 2,8. При довжині хвилі   450 нм, показники ОЕ суспензій еритроцитів були значно вищими ніж аналогічних суспензій лізованих еритроцитів. У цьому випадку зберігалася тенденція до зростання ОЕ як у нелізованих, так і лізованих еритроцитів від 0,44 до 1,62 і від 0,16 до 0,62 відповідно в залежності від концентрації еритроцитів. Результати дослідження нелізованих суспензій еритроцитів при   620 нм свідчать про поступове зростання показника ОЕ від 0,3 до 1,03 в залежності від концентрації еритроцитів. Аналогічні концентрації лізованих дистильованою водою суспензій еритроцитів мали значно 60429 4 меншу ОЕ 0,06-0,07 незалежно від концентрації еритроцитів досліджених суспензій (табл. 1). Таким чином, на моделі лізованих і нелізованих суспензій еритроцитів встановлено, що використання довжини хвилі   620 нм стабільно забезпечує цифровий облік ступеню оптичної екстинції різної густини нелізованих суспензій еритроцитів (0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %) і майже однакові низькі показники після повного лізису еритроцитів незалежно від концентрації. Зазначену методику спектрофотометрії   620 нм на рідері пропонується для обліку ступеня затримки гемолізу при обліку результатів у дослідженнях мікрометодом РЗК зразу після закінчення реакції без попереднього осадження еритроцитів. Приклад 2. Провели титрацію комплементу у гемолітичній системі і порівняння візуального та інструментального обліку мікрометоду РЗК. У реакції використали комерційну серію комплементу мурчака у розведенні 1:20, розчинник (0,85 % розчин NaCl), індикаторну гемолітичну систему (2,5 % відмитих еритроцитів барана у рівних об'ємах з гемолізином у подвійному титрі, 1:750). Сенсибілізацію еритроцитів гемолізином проводили упродовж 10 хвилин при 37 °С. У лунки мікроплат вносили автоматичною мікропіпеткою різні дози комплементу: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 мкл і відповідно розчинник (0,85 % розчин NaCl) в об'ємі 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 (кінцевий об'єм комплементу 20 мкл у кожній лунці). Замість антигену і сироватки у кожну лунку вносили по 40 мкл розчинника та по 40 мкл індикаторної гемолітичної системи. Мікроплати витримували на шейкері фірми ELMI Sky line, 100 С об./хв, 37 С 10 хвилин. Облік ступеню гемолізу проводили зразу після закінчення реакції візуально та інструментально на рідері фірми Tecan,   620 нм. Результати наведені в таблиці 2 свідчать, що візуально повний гемоліз (ПГ), оптична екстинція (ОЕ) 0,111 -0,072, виявили у лунках з дозою комплементу 10 мкл і більше. Дози комплементу 6 і 8 мкл візуально спричиняли частковий гемоліз еритроцитів (ЧГ), а відповідно інструментально ОЕ=0,282-0,689. При меньших дозах комплементу 2-4 мкл візуально спостерігали відсутність гемолізу еритроцитів (ВГ), відповідно інструментально - ОЕ=1,131-1,148. Таким чином, результати досліджень свідчать, що гемолітичний титр комплементу в розведенні 1:20 (мінімальна кількість комплементу, яка візуально спричиняє повний гемоліз, відповідно інструментально ОЕ 0,111) визначено в дозі 10 мкл у даному досліді. Високі цифрові показники оптичної екстинції 1,131,-1,148 свідчили про повну відсутність гемолізу (ВГ). Приклад 3. Провели дослідження активності трьох позитивних бруцельозних і однієї негативної сироватки крові, виготовлених ТОВ НДП «Ветеринарна медицина» на бичках упродовж 2004-2010 рр (лабораторний робочий стандарт). Для дослідження використали антиген бруцельозний єдиний для РА, РЗК, РТЗК, серія №1, контроль №1, 2009 p., робочий титр 1:75, Херсонське Державне підпри 5 60429 ємство біологічна фабрика. Постановку мікрометоду проводили у мікроплатах, 96 лунок, в об'ємі 100 мкл (по 20 мкл кожного компоненту). Сироватки крові у розведенні 1:5 інактували на водяній бані впродовж 30 хвилин при 62°С і досліджували у розведеннях від 1:5 до 1:640. Титр комплементу (одна гемолітична одиниця) становив 10 мкл в розведенні 1:20. В основний дослід мікрометоду РЗК була взята доза 14 мкл комплементу у розведенні 1:20 (три гемолітичних одиниці). Ставили відповідні контролі компонентів реакції на активність, специфічність, антикомплементарність. Результати досліджень наведені в таблиці 3 свідчать, що повну затримку гемолізу спостерігали у лунках з позитивними бруцельозними сироватками різних серій виготовлення у розведеннях від 1:5 до 1:40 або 1:320 # і відповідно оптичну екстинцію більше одиниці (1,196-1,267). Позитивні бруцельозні сироватки також реагували у розведенні 1:80 ++ (S1), 1:640 ++ (S2), 1:640 + (S3) тобто у лунках з антигеном мали часткову затримку гемолізу, від 6 повідно ОЕ 0,635;0,563; 0,384. Негативна сироватка у розведенні 1:5, 1:10 з бруцельозним антигеном не затримувала гемолізу і мала низьку ОЕ (0,192-0,191). Контролі позитивних бруцельозних і негативної сироваток (1:5) на антикомплементарність без антигену не спричиняли затримки гемолізу і мали низьку ОЕ 0,191-0,197. Контроль антигену на антикомплементарність, а також контроль активності комплементу у гемсистеми не спричиняли затримки гемолізу і мали низьку ОЕ 0,1970,111. У лунках з контролем стабільності гемсистеми з розчинником і контролем антигену з розчинником на гемотоксичність гемолізу не виявили, ОЕ становила 1,142-1,243. Отримані результати свідчать, що запропонований спосіб інструментального обліку результатів дослідження мікрометодом РЗК стабільно забезпечує чітке цифрове виявлення ступеню затримки гемолізу, є чутливим ефективним і може використовуватись в серологічній діагностиці інфекційних хвороб. Таблиця 1 Спосіб інструментального обліку результатів дослідження мікрометодом РЗК. Об'єкт дослідження, довжина хвилі, нм суспензія еритроцитів лізовані еритроцити суспензія еритроцитів лізовані еритроцити суспензія еритроцитів лізовані еритроцити 405 Результати спектрофотометрії ОЕ суспензій еритроцитів, 0,5 % 1,0 % 2,0 % 3,0 % 0,6 1,15 2,0 2,8 0,6 2,0 2,8 0,44 0,79 1,24 1,62 0,16 450 1,16 0,27 0,4 0,62 0,3 0,53 0,8 1,03 0,06 0,07 0,07 0,07 620 Таблиця 2 Спосіб інструментального обліку результатів дослідження мікрометодом РЗК Спосіб обліку РЗК 2 інструментально на рі- 1,131 дері,   620 ,ОЕ візуально гемоліз % 0 затримка # гемолізу ВГ Облік гемолітичної активності комплементу (1/20), дози, мкл 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,148 0,689 0,282 0,111 0,088 0,093 0,076 0,074 0,072 0 # ВГ 50 ++ ЧГ 75 + ЧГ 100 ПГ 100 ПГ 100 ПГ 100 ПГ 100 ПГ 100 ПГ 7 60429 8 Таблиця 3 Спосіб інструментального обліку результатів дослідження мікрометодом РЗК. Об'єкт дослідження Облік активності сироваток ) ОЕ, візуально г розведеннях, Контроль сироватки 1/5 без антигену 0,193 1/5 бруцельозна позитивна сироватка S1 бруцельозна позитивна сироватка S2 бруцельозна позитивна сироватка S3 негативна сироватка 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1,237 1,267 1,216 1,185 0,635 0,155 0,199 0,09 # 1,256 # 1,226 # 1,245 # 1,181 ++ 1,175 1,201 1,229 0,563 0,197 # 1,245 # 1,237 # 1,23 # 1,225 # 1,196 # 1,198 # 1,214 ++ 0,384 0,19 # 0,192 # 0,191 # # # # # + 0,191 Антиген без сироватки з комплементом А+Розч+К+ГС ОЕ 0,197 Контролі Антиген без сироватки і Гемсистема з комплекомплементу ментом А+Розч+Розч+ГС Розч+Розч+К+ГС ОЕ1,243 ОЕ0,111 # Гемсистема без комплементу Розч+Розч+Розч+ГС ОЕ1,142 # Позначення: затримка гемолізу ( #, ++, +) повний гемоліз (-) Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601