Антиген рикетсійний провачека з кишківників заражених вошей для діагностики висипного тифу в реакції зв’язування комплементу

Корисна модель належить до медицини, зокрема діагностики інфекційних хвороб, і може бути використана для серологічної діагностики епідемічного та рецидивного висипного тифу серед людей. В медицині відомо використання різноманітних серологічних методів (тестів) діагностики епідемічного та рецидивного висипного тифу. Одним із найбільш чутливих та специфічних тестів є реакція зв'язування комплементу (РЗК), яка дозволяє проводити серологічну діагностику в період гострого захворювання, реконвалесценції, ретроспективну діагностику раніше перенесених захворювань та довготривалу персистенцію рикетсій Провачека [1]. В якості антигену (діагностикуму) при постановці вказаного серологічного тесту використовують інактивовану масу збудника висипного тифу - рикетсій Провачека. Оскільки вказані рикетсії є облігатними паразитами, а їх накопичення можливе виключно в живих клітинах, вирощування рикетсій Провачека проводять на одній з біологічних моделей: в переносниках, в курячих ембріонах або на лабораторних тваринах (білі миші, морські свинки) [2]. Внаслідок того, що дві останні моделі є нетиповими для розмноження збудника висипного тифу, при довготривалому пасажуванні рикетсій Провачека на них можлива втрата специфічних властивостей збудника. Воші людини Pediculus humanus є природним переносником рикетсій Провачека, тому використання їх у якості моделі для нарощування маси рикетсій Провачека позбавлено вказаного недоліку. Як прототип взято "Диагностикум риккетсиозный Провачека сухой для РСК", виробництва пермського НВО "Биомед" [3]. Недоліком цього засобу є використання в якості біологічної моделі для накопичення маси рикетсій Провачека курячих ембріонів. Метою корисної моделі є розробка способу виготовлення антигену рикетсій Провачека з кишківників заражених вошей Pediculus humanus для діагностики висипного тифу в реакції зв'язування комплементу (РЗК). Названа мета досягалась в три етапи, а саме: одержанням маси рикетсій Провачека в кишківниках Pediculus humanus вошей лабораторної популяції (перший етап), інактивації їх (другий етап) та подальшим виготовленням із маси рикетсій антигену (третій етап). На першому етапі проводили інфікування виробничої партії вошей Pediculus humanus у віці 14 діб методом інтраректального зараження за допомогою мікроклізм (удосконалений метод Вейгля) [4]. В якості виробничих штамів рикетсій Провачека використовували 8 штамів (Зенейко, Катерина, Синяк, Дудкіна, Городок, Курій, Причко, Ярема), виділених на території України в період епідемічних спалахів висипного тифу в 40-50-х років минулого сторіччя. Для інфікування виробничої партії вошей Pediculus humanus використовували суспензію рикетсій Провачека з кишківників вошей Pediculus humanus, які попередньо були інфіковані цим збудником і загинули від висипнотифозної інфекції. Суспензія, яка була використана для інфікування виробничої партії вошей Pediculus humanus, виготовлена на розчині хлориду натрію при такому співвідношенні інгредієнтів, що пояснюється прикладом 1. Приклад 1 Суспензія рикетсій Провачека, яка використана для інфікування промислової партії вошей Pediculus humanus. Кишківники вошей Pediculus humanus лабораторної популяції, 3-4 штуки які загинули від висипнотифозної інфекції Розчин хлориду натрію 0,9% 1,0 мл На 4-9 доби після інфікування спостерігалось масове накопичення рикетсій Провачека в клітинах ендотелію кишківників вошей Pediculus humanus, що викликало масову загибель комах, а візуально визначалось в накопиченні +++ рикетсій Провачека в полі зору при забарвленні мазків ціанохіном за Айзенбергом [4]. На другому етапі проводили інактивацію рикетсій Проводили 0,5% розчином фенолу на 0,9% розчині хлориду натрію протягом 2-3 діб при температурі 4±1°С. На третьому етапі одержували суспензію рикетсій Провачека, для чого вошей Pediculus himianus, які знаходилась в розчині 0,5% фенолу на 0,9% розчині хлориду натрію, розбивали на подрібнювачі тканин при 8000 об/хв протягом 15 хвилин. Рикетсії з розбитих вошей знаходились в розчині, утворюючи суспензію. Для видалення хітинових оболонок, які на подрібнювачі тканин не розбиваються, суспензію рикетсій фільтрували через капронове сито №35 у мірний циліндр. Осад на фільтрі промивали невеликою кількістю розчину 0,5% фенолу на 0,9% розчині хлориду натрію, доводячи загальний об'єм інактивованої рикетсійної суспензії до 0,6л (при виготовленні 1,0л антигену). Для видалення з утвореної суспензії гомогенізованих кишківників вошей більш частинок, які пройшли скрізь сито, її центрифугували протягом 3-5 хвилин при 2500-3000об/хв. Надосад зливали в стерильну колбу і зберігали в холодильнику при температурі 4°±1°С та використовували для подальшого виготовлення антигену. Отриманий після першого центрифугування надосад ресуспендували на апараті типу АВУ-1 із додаванням 300,0мл розчину 0,5% фенолу на 0,9% розчині хлориду натрію протягом 5 хвилин і повторно центрифугували 5хв. при 2500-3000об/хв. Одержану порцію надосаду зливали в колбу, доводили загальний об'єм 0,5% фенолом на 0,9% розчині хлориду натрію до 1,150мл та залишали на декілька діб у холодильнику для осідання осаду, який може утворюватись під дією фенолу. Після закінчення часу експозиції проводили титрування антигену за звичною методикою [5], що пояснюється наведеним нижче прикладом 2 (табл.1). Приклад 2. Таблиця 1 Схема титрування антигену Ряд Пробірок 1 2 Інгредієнти, мл не розведений Антиген 0,2 Сироватка специфічна 0,2 Комплемент 0,2 Фізіологічний розчин Антиген 0,2 Розведення антигену 1:2 1:4 1:8 1:16 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Контролі Комплемент сироватки у 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 Сироватка неспецифічна 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Комплемент 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Фізіологічний розчин 0,2 3 Антиген 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Фізіологічний розчин 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Комплемент 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Поміщають на 60±5 хвилин в термостат (37±1°С) Додають гемолітичну систему по 0,4мл з 3% еритроцитів Поміщають у термостат (37°±1°С) на 30±1 хвилин Облік результатів: 1 Специфічна сироватка ++++ ++++ +++ + 2 Неспецифічна сироватка 3 Без сироватки Одержаний антиген рикетсійний Провачека з кишківників заражених вошей характеризується рядом ознак, які пояснюються наведеним нижче прикладом 3 (табл.2). Приклад 3 0,2 0,4 Pediculus humanus Таблиця 2 Основні показники якості антигену рикетсійного Провачека з кишківників заражених вошей для діагностики висипного тифу в реакції зв'язування комплементу Найменування показників контролю 1. Опис 2. Мікробіологічна чистота 3. Специфічна нешкідливість 4. Автентичність і специфічна дія 5. Термін придатності Встановлені значення Мутна рідина світло-коричневого кольору. При зберіганні утворюється осад, який розбивається при струшуванні Допускається не більше 3-х мікробних клітин в одному полі зору мікроскопа Препарат повинен бути нешкідливим Позитивний результат у реакції зв'язування комплементу із імунною сироваткою. Титр антигену повинен становити не менше 4 антигенних одиниць (АО). Негативний результат реакції із гетерогенною сироваткою 1 рік Методи контролю Візуальний огляд Мікроскопічний Випробовування на лабораторній культурі вошей РЗК Одержаний антиген із рикетсій Провачека використовували при дослідженні сироваток крові в реакції зв'язування комплементу (РЗК) за звичайною методикою [5], а саме: досліджувану сироватку (інактивовану при 56±1°С протягом 30±1хв.) розводили 0,9% розчином хлориду натрію (наприклад, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560) у пробірках об'ємом 0,2мл. До розведеної сироватки додавали по 0,2мл антигену та 0,2мл комплементу. Пробірки старанно струшували й поміщали в термостат при температурі 37±1°С на 60±5хв. Після експозиції у всі пробірки додавали по 0,4мл гемолітичної системи та ретельно струшували й ставили в термостат при температурі 37±1°С до завершення гемолізу в контрольних рядах, орієнтовно на 30±1хв. Реакцію супроводжували контролями, а саме: досліджуваної сироватки (№1), препарату (№2), комплементу (№3), гемолітичної системи (№4). Облік результатів проводили неозброєним оком по чотирьох плюсовій системі. Позитивною вважали реакцію при затримці гемолізу не менше, ніж на два плюси. Реакцію вважали достовірною при наявності повного гемолізу у контролях №№1-3 та повній затримці гемолізу у контролі №4. Таким чином, було одержано високо специфічний антиген з рикетсій Провачека, культивованих у кишківниках вошей Pediculus humanus за удосконаленим методом Вейгля. Для виготовлення 1000,0мл антигену було використано 9700 кишківників вошей Pediculus humanus, які загинули від висипнотифозної інфекції. За титр одержаного антигену приймали його найбільше розведення, яке давало позитивну реакцію зі специфічною імунною сироваткою до її титру. Антиген повинен реагувати до титру специфічної імунної сироватки в розведенні не менше 1:4, тобто містити не менше 4 АО в робочому розведенні. Література: 1. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах,-М.:Медицина, 1972-495с. 2. Здродовский П.Ф., Соколов М.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней.- М.: Медицина, 1965.-591с. 3. Инструкция по применению диагностикума риккетсиозного Провачека сухого для РСК / Утверждено Главным государственным санитарным врачем Российской Федерации 01.02.1999г. 4. Мосинг Г.С. Культивирование риккетсий во вшах // Многотомное руководство по микробиологии и єпидемиологии инфекционных болезней.-М.: Медгиз, 1962. -Т2. - С.468-482. 5. Методичні рекомендації з лабораторної діагностики рикетсіозів / Затверджені Наказом МОЗ України №598 від 22.12.2003p.- Київ. -2003 - 51с.