Спосіб діагностики збудника сибірки

1 Спосіб діагностики збудника сибірки у повітрі, воді і твердих субстратах, що включає мікроскопію забарвлених за Грамом мікроскопічних мазків, висів контамшованого матеріалу на штучні живильні середовища і зараження ним чутливих лабораторних тварин, який відрізняється тим, що суспензію досліджуваного матеріалу (порошок, змиви з об'єктів навколишнього середовища, стерилізуючих фільтрів тощо) змішують з люмінесцентною сумішшю спеціального складу акридиновий оранжевий 1,0-1,5, спирт етиловий ректифікований 96° -20 і димексид - 20,0, 1 %-ний водний розчин їдкого калію - 1,0, 10 %-ний відвар лушпиння цибулі ріпчастої 20,0-30,0, вода дистильована до 3 100 см , нагрівають до 80-90°С і забарвлюють 2030 хвилин, центрифугують 3-6 хв при 3000 об/хв , надосадкову рідину зливають, осад промивають 23 рази в 5-10 об'ємах фізіологічного розчину, з осаду готують мазки "роздавлена крапля" і досліджують в люмінесцентному мікроскопі - спори сибірки яскраво оранжеві, осад висівають в живильне середовище спеціальної імунодифузійної тестсистеми з застосуванням відомих комерційних антитоксичних сибіркових сироваток в метою виявлення екзотоксину збудника сибірки 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що реакцію імунодифузм проводять з токсин-вакциною "Антракол" Для діагностики збудника сибірської виразки (сибірки) застосовують велику КІЛЬКІСТЬ методів досліджень У ВІДПОВІДНОСТІ з найбільш поширеною схемою (А С Лабинская Микробиология с техникой микробиологических исследований - М медицина 1978- 394 с ) , діагностика сибірки in vivo, проводиться таким чином у перший день досліджень відбирають пробу крові, мокроти або вміст сибіркового карбункула хворої тварини і готують мікроскопічні мазки Один мазок фарбують за Грамом, другий - з метою виявлення капсульних форм бацил за Романовським-Гімаа Підставою для постановки попереднього діагнозу на сибірку є виявлення в пробах грампозитивних, оточених капсулою поодиноких палочок або їх ланцюжків та опор Основний недолік способу - часта відсутність капсульних форм, в зв'язку з чим збудника сибірки можна сплутати з сапрофітними бациламиантракоідами Вас cereus, Вас mesentencus Вас megatherium, Вас mycoides, Вас anthracoides, Вас pseudoanthraois В зв'язку з цим для точного діагнозу необхідно виділити чисту культуру збуд ника і поставити бюпробу на чутливих лабораторних тваринах, а потім, після їх захворювання, КЛІНІЧНОГО огляду і загибелі, знову виділити чисту культуру та діагностувати збудник хвороби Таким чином, загальний час, необхідний для отримання вірогідного результату становить 8-10 діб, що не відповідає основній вимозі встановлення діагнозу в найкоротший термін для налагодження своєчасних профілактичних і лікувальних заходів Ідентифікацію збудника сибірки проводять за допомогою проби сибірковим бактеріофагом (Н Г Ипатенко Лабораторные методы исследования при сибирской язве // Ветеринария - 1983, №7, Н Г Ипатенко Дифференциации Вас anthracis от спорообразующих и почвенных бациллу / Ветеринария - 1995 - №7) Реакція досить специфічна і дозволяє віддиференціювати його від псевдосибіркових бацил Незважаючи на високу чутливість цього способа діагностики і його різних модифікацій, проба бактеріофагом вимагає попереднього виділення чистої культури сибірки із патологічного матеріалу або навколишнього середовища, на що йде до 48 годин Крім того, необхідний час для со (О 61391 постановки бюпроби, на що витрачається ще декілька діб Іншим недоліком методу є те, що він діагностує не тільки патогенні, але й авірулентні штами Слід врахувати також той факт, що у природі існують патогенні штами збудника сибірської виразки не чутливі до бактеріофага та сапрофітні бацили, які лізуютьоя під впливом сибіркового бактеріофагу (Н Г Ипатенко, В А Гаврилов, В С Зелепукин и др Сибирская язва - М Колос, 1996 335с) З метою прискореної діагностики збудника сибірки застосовують тест "бурштинового намиста" При цьому на агаризоване середовище з пеніциліном, яке попередньо розливають у чашки Петрі, наносять бактеріологічною петлею трьохгодинну бульйонну культуру досліджуваного мікроорганізма Із колоній, що виростають на згаданому середовищі, готують мазки для мікроскопи На контрольному середовищі (без додавання пеніциліну) виростають колонії звичайних бацил, а на дослідному - колони, утворені клітинами кулястої форми, з'єднаними у ланцюжки - "бурштинове намисто" В останньому випадку ставлять діагноз - сибірка Однак, як і в попередньому аналозі, спосіб "намиста" не дозволяє відрізняти патогенні штами сибірки від авірулентних і, вимагає додаткових доказів Крім відзначеного, в природі існують вірулентні бацили сибірки не чутливі до пеніциліну, а також бацили цереуса, здатні набувати кулястої форми під дією цього антибіотика Фармаконцерн Роше у кооперації з фірмою Gentest (США) та деякі ІНШІ ДОСЛІДНИКИ ДЛЯ швидкої діагностики збудника сибірки, в тому числі, в складі біологічної зброї, пропонують застосовувати широковідомий метод ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) (Fredenks D N , Relman D A Application of pohmerase chain reaction to the diagnosis of Infections diseases //Clm Infect Dis -1999 - v 29 p 457-458, http //www handellsblatt comm/hbiwwwanyebot/fn/reh Ibi/sfn/buildhbi/on/GoArt /index htm 09 12 01) Оптимізм авторів щодо ефективності цього способу розділити важко, через такі причини по-перше, для проведення ПЛР-тесту із підозрюваного матеріалу спочатку необхідно виділити чисту культуру сибірки, потім виділити і очистити ДНК, на що піде досить багато часу, по-друге, існує висока ймовірність отримання псевдопозитивного результату, внаслідок присутності ДНК антракоідів, або навпаки, псевдонегативного результату (інгібування реакції, внаслідок біологічного забруднення), потретє, багатоетапність методики очищення і концентрування бактеріальної ДНК, як і самий аналіз, вельми трудомісткі і дорогі та вимагають створення складних стаціонарних молекулярнобіологічних лабораторій Найближчими до запропонованого нами способу діагностики збудника сибірки відносяться такі Реакція преципітації за Асколі її суть полягає в тому, що матеріал, підозрюваний на наявність збудника сибірки, екстрагують гарячим або холодним способом Отриманий при цьому екстракт в КІЛЬКОСТІ 0,2-0,3 смз наслоюють на такий же об'єм прозорої преципітуючої протисибіркової сироватки в уленгутовській пробірці В разі позитивної реакції (наявність антигену бацил сибірки) протягом 2 хвилин після сполучення згаданих компонентів з'являється характерне молочно-білого кольору кільце преципітації Проте, цей спосіб має слабкі місця, а саме а) реакція може бути позитивною навіть при відсутності життєздатних бацил і спор сибірки, що призводить до економічних втрат (знищення всієї партії тваринної сировини) б) за умови отримання негативного результату реакції преципітації з екстрактом, отриманим за допомогою гарячого способу, вимагається повторний аналіз з холодним екстрактом і навпаки, в) при розтиранні шматочків патологічного матеріалу, кормів або інших щільних субстратів у ступці з піском існує небезпека забруднення повітря чи оточуючих предметів, а також людей спорами сибірки, г) для постановки реакції Асколі потрібний стандартний антиген, що також ускладнює проведення бютеста Відомий люмінесцентно-серологічний метод виявлення бацил сибірки з використанням високоспецифічних імунних капсульних протисибіркових сироваток, кон'югованих з люмінесцентним фарбником Наявність збудника сибірки констатується під люмінесцентним мікроскопом у вигляді палочок і/або їх ланцюжків, які дають зелено-жовте свічення Капсули світяться яскравіше Основним недоліком цього методу є те, що свічення можуть давати антракоідні бацили Отже, постає необхідність підтвердження діагнозу бюпробою на лабораторних тваринах Задачею винаходу є розробка надійного способу діагностики збудника сибірки в будь-якому матеріалі тваринницькій сировині, ґрунті, воді, повітрі, в тому числі у біологічній зброї, який би відрізнявся найкоротшим терміном постановки остаточного діагнозу, високою чутливістю і простотою застосування з врахуванням польових умов Поставлена задача досягається наступним чином Наважку досліджуваного на можливість контамінації збудником сибірки матеріалу (порошок, корми, шкірсировина, грунт тощо) в КІЛЬКОСТІ 0,51,0 г заливають розчином фарбника у відношенні 1 2 - 1 5 такого складу акридиновий оранжовий 1,0-1,5, спирт-ректифікат 96° і димексид - по 20,0 1% водний розчин їдкого калію - 1,0, 10%-ний відвар цибулиння (цибуля ріпчаста) - 30,0, вода дистильована до 100,0 Пробірку з сумішшю нагрівають ЗО хв при 80-90° С, охолоджують, центрифугують, надосадочну рідину вилучають Осадок промивають 2-3 рази в 5-10 об'ємах дистильованої води Після КОЖНОГО додавання води пробу центрифугують при 3000 об/хв 5-10 хв Після промивання осаду надосадочну рідину виливають, а з осадку готують мазки "роздавлена крапля" і досліджують під люмінесцентним мікроскопом Спори мають яскраво оранжевий колір Для постановки остаточного діагнозу ставлять дослід з тест-системою її готують наступним чином На дно чистої бактеріологічної пробірки вносять 0,5-1,0 ом 3 комерційної антитоксичної сибіркової сироватки або сироватки "Антракол" На сироватку нашаровують підігрітий до 42-43°С 1%ний прозорий гель агар-агару, приготовлений на фізіологічному розчині (0,85% водний розчин на 61391 трію хлористого) Пробірку ставлять вертикально до застигання агару Після цього на поверхню агару вносять 1-2 см 3 рідкого живильного середовища, наприклад, м'ясо-пептонний бульйон з додаванням сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ) і глюкози, в яке вносять 0,2-0,Зсм3 суспензії забарвленого осаду Після цього пробірки ставлять в термостат при 37°С на 12-15 годин Пробірки переглядають в проникаючому СВІТЛІ на чорному фоні, як при обліку реакції Асколі За наявності в досліджуваному матеріалі збудника сибірської виразки в агаровому гелі формується кільце преципітації В процесі росту на живильному середовищі тільки бацили сибірки продукують і виділяють назовні (за межі клітинної стінки) токсин, який, дифундуює в агаровй гель і зв'язується антитілами преципітуючої сироватки Антракоідні бацили диску преципітації не утворюють Таким чином, в результаті запропонованих нами лабораторних досліджень попередній діагноз ставлять через ЗО - 60 хв , остаточний - через 12 15 годин Приклади реалізації способу Приклад 1 Порошок, підозрюваний на вміст спор сибірської виразки поміщають в пробірку в КІЛЬКОСТІ 0,3 г і заливають у пропорції 1 5 розчином фарбника такого окладу, акридин оранжевий 1,0-1,5, спирт-ректифікат 96°- 20,0, димексид 20,0, 1%-ний водний розчин калію їдкого 1,0, 10%ний відвар цибулиння - 30,0, вода дистильована до 100 см 3 Пробірку із сумішшю нагрівають при 80°С протягом 20 хв , охолоджують, центрифугують, надосадочну рідину виливають Осадок промивають 3 рази в 5 см 3 дистильованої води Після кожного додавання води проводять центрифугування при 3000 об/хв , 7 хв Паралельно проводять аналогічну процедуру з порошком сухого молока коров'ячого (контроль), виготовленого за ГОСТ 13264 - 70 на Яготинському молокозаводі (Київська область) З осадків дослідної і контрольної пробірок готують мікроскопічні препарати типу "роздавлена крапля" і досліджують під люмінесцентним мікроскопом В ДОСЛІДНІЙ пробірці виявлені яскраво оранжеві спори, в контрольній - ні З метою підтвердження діагнозу ставлять спеціальний бютест з комерційною антитоксичною сибірковою сироваткою В пробірки з дослідним і контрольним осадами додають по 1см3 стерильного фізіологічного розчину, перемішують і засівають по 0,2см3 суспензії на тест-системи, виготовлені як зазначено в описі винаходу Склад живильного середовища тест-системи такий 1см3 м'ясопептонного бульйону, 1см3 шактивованої сироватки крові ВРХ та 1% глюкози Пробірки з тестсистемою ставлять в термостат при 37°С на 12 15 годин При обліку результатів імунодифузної реакції через 12 годин в ДОСЛІДНІЙ пробірці виявлено характерне кільце преципітації В контролі диск преципітації відсутній Приклад 2 Вода поверхневого джерела, підозрювана на зараження спорами сибірки В стерильні пляшки відбирають по 0,5дм3 води для дослідження на предмет контамінації и опорами сибірки Воду фільтрують через бактеріологічні мембранні фільтри №3 (діаметр пор - 0,3 мкм) за допомогою фільтра Зейтца Після цього мембранні фільтри перевертають і промивають їх 100 см 3 фільтрату Отриману суспензію прогрівають на водяній бані 20 хв при 75°С, охолоджують Потім роблять серію кратних розбавлень у стерильній водопровідній воді і 1см3 суспензії засівають на чашки Петрі з застиглим агаризованим середовищем (склад середовища як в прикладі 1) Чашки Петрі ставлять в термостат при 37°С Через 3-6 годин інкубації чашки Петрі оглядають з метою виявлення колоній, характерних для бацил сибірки Це плоскі матово-сірі шорсткі (R-форма) колонії з бахромчатими краями або кучероподібними відростками Підраховують загальну КІЛЬКІСТЬ КОЛОНІЙ спороутворюючих мікроорганізмів та число колоній, схожих за морфологічними ознаками на колони збудника сибірки За допомогою бактеріологічної петлі з колоній відбирають матеріал для посіву в пробірку з бютестом, що містить антитоксичну сибіркову сироватку (як в прикладі 1) Огляд пробірок через 12 і 15 год інкубації не виявив кільця преципітації Отже, досліджувана вода не контамінована спорами сибірки, а містила спори сапрофітних бацил Приклад 3 Дослідження ділянки ґрунту, що підозрюється на забруднення спорами сибірської виразки Методом випадкових вибірок відбирають проби ґрунту масою до 100,0г в стерильні банки з кришками В лабораторії з проби ґрунту вилучають крупні частинки рослин, коренів тощо, грунт перемішують, зважують 30г і заливають його 30см3 0,5%-ного розчину піросульфату натрію Суміш шуттелюють 20хв і відотоють 5 хв Надосадкову рідину зливають і фільтрують через стерилізуючу мембрану фільтра Зейтца Після цього фільтр промивають 10 см 3 стерильної водопровідної води, центрифугують 10 хв при 3000 об/хв Надосадкову рідину зливають Отриманий осадок ресуспендують в розчині люмінесцентного фарбника і фарбують як відзначено в прикладі 1 Аналогічно готують пробу контрольного (завідомо чистого) грунту Із дослідного і контрольного осадів готують препарати "роздавлена крапля" і досліджують під люмінесцентним мікроскопом В дослідному і контрольному зразках грунту виявлено спори, забарвлені в оранжевий колір Після цього ставлять бютеста з антитоксичною сибірковою сироваткою "Антракол" Дослідну і контрольну пробірки з бюсистемами інокулюють ВІДПОВІДНО ПО 0,5СМ 3 ДОСЛІ ДНОГО І контрольного матеріалу і ставлять їх в термостат при 37°С Через 12 годин інкубації виявлено чітке кільце преципітації в агаровому диску дослідної проби Контрольный зразок грунту кільця преципітації не дав Приклад 4 В герметичній камері КПГ-1 розпилюють суспензію опор штаму Вас anthracis Після цього в допомогою волюнометричного відбирача зразків з атмосфери (фірма "Буркхард", Великобританія) з камери відкачують повітря впродовж 6 хв , яке пропускається через спеціальну барботажну камеру з 0,5%-ним водним розчином препарату бактеріального екзополісахариду "Бактозоль" (свідоцтво на знак для товарів і послуг № 7946 від 12 07 2001 р) Розчин прогрівають при 80°С 20 хв і центри 61391 фугують, надосадочну рідину зливають, осад тричі промивають, потім його змішують з розчином фарбника, фарбують, як в прикладі 1 3 осаду готують препарати "роздавлена крапля" і проводять мікроскопію під люмінесцентним мікроскопом В результаті виявлено яскраво оранжеві спори З метою підтвердження попереднього діагнозу з допомогою бактеріологічної петлі з осаду відбирають посівний матеріал, яким засівають пробірку з підготовленою тест-системою і ставлять в термостат при 37°С Шляхом візуального обліку результату реакції через 13 год інкубації виявлено чіткий диск преципітації Отже, в пробі досліджуваного повітря містяться опори сибірської виразки Переваги запропонованого способу Практично всі ВІДОМІ методи діагностики сибірки вимагають обов'язкового виділення чистої культури збудника, дослідження його морфологічних і культурально-бюхімічних властивостей, постановки бюпроби з наступною ІЗОЛЯЦІЄЮ ІЗ організмів загиблих лабораторних тварин збудника та його ідентифікації На ці процедури витрачається від 7 до 10 діб, що не дозволяє своєчасно організувати ВІДПОВІДНІ лікувально-профілактичні заходи та призводить до великих втрат В порівнянні з відомими аналогами, запропо Комп'ютерна верстка М Клюкш 8 нований спосіб діагностики має низку переваг 1 Час постановки попереднього діагнозу становить ЗО - 60 хв , остаточного - до 12 -15 год , що дозволяє оперативно вжити всі необхідні лікувально-профілактичні заходи, особливо, у випадку застосування опор сибірської виразки в якості біологічної зброї 2 Для постановки остаточного діагнозу (проведення бютесту з антитоксичною сибірковою сироваткою) не обов'язково виділяти чисту культуру збудника сибірки, його можна проводити з накопичувальною культурою 3 Запропонований спосіб експрес-діагностики збудника сибірки є простим, надійним і економічним Наприклад, порівняно з ПЛР - методом, який до того ж часто дає псевдопозитивний або псевдонегативний результати, він дешевший в сотні разів і його можна втілювати в польових умовах 4 Запропонований спосіб експрес-діагностики дозволяє максимально скоротити втрати живої сили військ і населення від зараження сибіркою при застосуванні відповідної бюзброї шляхом масової імунізації людей токсин-вакциною "Антракол", яку можна вводити за допомогою безгодкового ін'єктора Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119