Спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів

Спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів, що включає змішування його з кріозахис 3 В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів, в якому б шляхом зміни складу кріозахисного середовища і умов заморожування забезпечувалась можливість підвищити показник РГШ, зберігаючи при цьому високий рівень показників агрегації, і таким чином досягти більш високої функціональної активності кріоконсервованого концентрату тромбоцитів. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування концентрату тромбоцитів, що включає змішування його з кріозахисним середовищем, що містить кріопротектор ДМАЦ в плазмі, і повільне заморожування з подальшим зануренням у рідкий азот, згідно з корисною моделлю, в кріозахисне середовище додатково вводять кріопротектор оксіетильований гліцерин зі ступенем полімеризації n=5 (ОЕГn=5), при чому кінцева концентрація кожного з кріопротекторів становить 2,5%, після змішування концентрату тромбоцитів з кріозахисним середовищем здійснюють експозицію протягом 30 хв., а заморожування зразків проводять в парах рідкого азоту при температурі 188...-193°С. Використання у якості кріозахисного середовища комбінації проникаючого кріопротектору ДМАЦ і напівпроникаючого ОЕГn=5, дає змогу здійснити принципово різні механізми кріозахисної дії, що сприяє отриманню більш високого показника РГШ, і зберегти високі показники агрегації, забезпечуючи таким чином високий рівень функціональної активності кріоконсервованого концентрату тромбоцитів, потрібний для його клінічного застосування. Експозиція з кріозахисним середовищем протягом 30 хв. забезпечує оптимальне насичення тромбоцитів кріопротекторами. Спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів, що пропонується, дозволяє збільшити показник РГШ на 25-35%, при цьому інші показники зберігаються на рівні найближчого аналога. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1 Концентрат тромбоцитів отримували з 500 мл донорської крові (гемоконсервант «Глюгіцир») методом із лейкотромбоцитарного шару, з використанням рефрижераторних центрифуг (ЦРЛ 05-01 і К-80) і системи пластикатних контейнерів («Гемакон» і «Компопласт») [4]. Отриманий концентрат тромбоцитів зберігали при 22±2°С протягом 12-16 год. на автоматичній мішалці зі швидкістю обертання 2 об/хв. Перед заморожуванням середовище, що містить ДМАЦ і ОЕГn=5, повільно, 1:1 додавали до концентрату тромбоцитів. Кінцева концентрація кожного з кріопротекторів 2,5%, тривалість експозиції з моменту додавання кріозахисного середовища до охолодження зразків 30 хв. Заморожування здійснювали у полімерних контейнерах (30×100 мм) ємністю 10 мл. Об'єм за 61471 4 морожуваних зразків складав 6 мл. Контейнери зі зразками заморожували в парах рідкого азоту при температурі -188...-193°С і через 15-18 хв. контейнери занурювали у рідкий азот (-196°С). Після розморожування на водяній бані при 37°С визначали кількість клітин у деконсервованих зразках. Функціональну активність кріоконсервованих тромбоцитів оцінювали після видалення кріопротекторів [5]. Отримані результати вимірювання показників функціональної активності виражали у відсотках по відношенню до відповідних показників свіжовиділених концентратів тромбоцитів. Результати наведені у Таблиці 1 у порівнянні з найближчим аналогом. З Таблиці 1 видно, що показник РГШ тромбоцитів кріоконсервованих за заявленим способом, значно перевищує показник РГШ, отриманий за найближчим аналогом. Показники АДФ-агрегації і колаген-агрегації залишаються на високому рівні, який достовірно не відрізняється від показників агрегації, отриманих за найближчим аналогом. Приклад 2 Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що перед заморожуванням до концентрату тромбоцитів додавали розчини, які містили ДМАЦ і ОЕГn=5 у різній кінцевій концентрації. Результати наведені у Таблиці 2. З Таблиці 2 видно, що найкращі показникі кількісної збереженості і функціональної активності тромбоцитів отримані при застосуванні кріозахисного середовища 2,5% ДМАЦ у поєднанні з 2,5% ОЕГn=5, що пояснюється вибором оптимальної концентрації кріопротекторів у середовищі. Приклад 3 Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що перед заморожуванням змінювали час експозиції тромбоцитів з кріозахисним середовищем. Результати наведені у Таблиці 3. З Таблиці З видно, що найкращі показники кількісної збереженості і функціональної активності кріоконсервованих тромбоцитів отримані після 30 хв. експозиції з кріозахисним середовищем, що пояснюється оптимальним насиченням тромбоцитів кріопротекторами. Приклад 4 Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що заморожування проводили за різних умов: І - в парах рідкого азоту при температурі -188...-193°С з послідуючим зануренням у рідкий азот (-196°С); II - в парах рідкого азоту при температурі -40...-45°С з послідуючим зануренням у рідкий азот (-196°С); III - занурення у рідкий азот (-196°С). Результати наведені у Таблиці 4, з якої видно, що найкращі результати отримано після заморожування у парах рідкого азоту при температурі -188...-193°С з послідуючим зануренням у рідкий азот. 5 61471 6 Таблиця 1 Функціональна активність тромбоцитів в залежності від способу кріоконсервування Показник, % Кількість клітин АДФ-агрегація Колаген-агрегація РГШ Ретракція Заявлений 95,5±5,0 55,7±10,4 50,4±18,9 69,7±11,5 85,7±10,2 За найближчим аналогом 64,5±9,0 42,3±6,0 39,0±6,0 Таблиця 2 Функціональна активність кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від концентрації кріопротекторів Показник, % Кількість клітин АДФ-агрегація Колаген-агрегація РГШ Ретракція 1,25%ДМАЦ + 1,25% ОЕГn=5 93,3±3,8 23,5±4,3 20,5±5,8 33,0±9,0 51,3±8,7 2,5% ДМАЦ + 2,5% ОЕГn=5 95,5±5,0 55,7±10,4 50,4±18,9 69,7±11,5 85,7±10,2 3,75% ДМАЦ + 3,75% ОЕГn=5 88,0±7,0 16,8±7,8 29,3±7,3 30,5±5,9 60,5±9,0 Таблиця 3 Функціональна активність кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від часу експозиції з кріозахисним середовищем Показник, % Кількість клітин АДФ-агрегація Колаген-агрегація РГШ Ретракція 15 хв. 88,3±4,5 23,3±7,6 32,0±5,3 58,3±12,8 85,8±13,8 30 хв. 95,5±5,0 55,7±10,4 50,4±18,9 69,7±11,5 85,7±10,2 60 хв. 91,2±3,0 22,4±7,2 21,0±8,0 29,8±7,4 79,0±14,0 Таблиця 4 Функціональна активність кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від умов заморожування контейнерів Показник Кількість клітин, % АДФ-агрегація, % РГШ, % Ретракція, % І 95,5±5,0 55,7±10,4 69,7±11,5 85,7±10,2 Джерела інформації: 1. Arnaud F., Kapnik E., Meryman H.T. Use of hollow fiber membrane filtration for the removal of DMSO from platelet concentrates // Platelets. - 2003. - Vol. 14, №3. - P. 131-137. 2. Кузнецов K.B., Сведенцов Е.П., Утемов С.В., Турина Н.М., Костяев А.А. Результаты реакции на гипотонический шок (РГШ) размороженных донорских тромбоцитов с криопротекторами «Кримолит» и «Тромбокриодмац» через 6 и 12 месяцев хранения при -80°С // Мат. конф. «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии». Проблемы гематологии и переливания крови. - 2005. - №1. - С. 40-41. II 90,3±6,5 30,0±4,3 51,4±7,4 79,2±11,2 III 91,0±8,2 1,4±0,45 15,8±1,4 32,0±11,4 3. Компанієць A.M., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблеми кріобіології. - 2006. - Т. 16, №2. - С. 182191. 4. Аграненко В.А., Компанией; A.M., Балезина Л.В. Выделение концентратов тромбоцитов из ЛТС донорской крови и их консервирование // Гематология и трансфузиология. - 1991. - Т.36, №3. С. 29-32. 5. Грищенко В.І., Компанієць A.M., Книш О.В. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів. Патент України №15014, А01N 1/02, 15.06.2006. 7 Комп’ютерна верстка А. Рябко 61471 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601