Спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів людини

Спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів людини, який включає змішування його з кріозахисним розчином, що містить кріопротектор 1,2-пропандіол на аутологічній плазмі, і програмне заморожування з наступним зануренням у рідкий азот, який відрізняється тим, що кріозахисний розчин додатково містить кріопротектор диметилацетамід, при цьому кожний з кріопротекторів беруть в концентрації 0,3М, а заморожування здійснюють спочатку до температури кристалізації суспензії зі швидкістю 1 град./хв., потім для зняття переохолодження проводять температурне ініціювання кристалоутворення і далі заморожують зі швидкістю 1град./хв. до -35...-40°С з наступним зануренням у рідкий азот. Винахід належить до галузі кріобіології та кріомедицини і може бути використаний у практичній медицині для трансфузій при лікуванні тромбоцитопеній різного походження. Існує спосіб кріоконсервування тромбоцитів людини у кріозахисному середовищі, що містить 6%-ний розчин ДМСО на аутологічній плазмі [1]. Згідно зі способом клітинну суспензію спочатку охолоджують від кімнатної температури до 0°С зі швидкістю 5 град./хв., при 0°С застосовують 5-хвилинну еквілібрацію і далі охолоджують до -5°С зі швидкістю 1град./хв, від -5°С до -15°С - 2град./хв, від -15°С до -45°С - 1град./хв, від -45°С до -70°С 5град./хв. з подальшим зберіганням при температурі -95°С. Відігрів здійснюють на водяній бані при температурі 37°С. Недоліком цього способу є те, що він потребує додаткового відмивання відігрітих клітин від кріопротектору для зменшення токсичного впливу на хворих продуктів розпаду ДМСО. Саме з цієї причини концентрат тромбоцитів, який був кріоконсервований з додаванням розчинів ДМСО, не знайшов широкого клінічного використання. До того ж відмивання тромбоцитів від ДМСО призводить до додаткових втрат та пошкоджень клітин [2]. Відомий спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів з додаванням розчину кріопротектору диметилацетаміду (ДМАЦ ) на воді для ін'єкцій у концентрації 0.29М (2,5%) з додаванням 2,5% глюкози [З]. Згідно з цим способом суспензію клітин після змішування з кріозахисним розчином повільно охолоджують з послідуючим занурюванням у рідкий азот. Недоліком способу є низькі показники біологічної повноцінності клітин тромбоцитів після кріоконсервування - кількісна збереженість клітин складає не більш 80%, при цьому лише 50% з них зберігають життєздатність та функціональну активність. Найбільш близьким до заявленого є спосіб кріоконсервування тромбоцитів людини [4], згідно з яким концентрат тромбоцитів змішують з розчином кріопротектору 1,2-пропандіолу на аутологічній плазмі до кінцевої концентрації 0,5М (3,9%), помішують у поліпропіленові ампули об'ємом 5 мл та заморожують до -5°С шляхом розташування їх на 5хв. у сидінговій бані, далі охолоджують зі швидкістю 14 град./хв. до -70°С, після чого занурюють у рідкий азот. Відігрів здійснюють на водяній бані при температурі 37°С. (19) UA (11) 84775 (13) C2 (21) a200700161 (22) 05.01.2007 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ, U A, ГУРІНА ТЕТЯН А МИХАЙЛІВН А, U A, КНИШ ОКСАНА ВАСИЛІВНА, U A, КОМПАНІЄЦЬ АНТОНІНА МИХАЙЛІВН А, U A (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ Н АУК УКРАЇНИ, U A (56) Аграненко В.А., Файнштейн Ф.Э., Голубева В.Л., Абакумов Е.М., Воробьева Г.С. Криоконсервированные тромбоциты и их клиническая эффективность // Гематология и трансфузиология.-1987.№5.-С.8-12 3 84775 Недоліком цього способу є те, що він не дає можливості отримувати концентрат тромбоцитів з достатньо високими показниками біологічної повноцінності. Кількісна збереженість клітин після розморожування становить 86,3± 7,3%, РГШ 12,4 ± 2,7%, агрегація на АДФ 3,8 ± 0,9 %. Крім того концентрат тромбоцитів має високу кінцеву концентрацію кріопротектору. Відомо, що при клінічному застосуванні кріоконсервованих компонентів крові, які заморожують з використанням кріозахисного розчину на основі 1,2-пропандіолу, дозволена одноразова залишкова доза кріопротектору для внутрішньовенного введення становить не більш 15г [5]. Одна лікувальна доза при трансфузіях концентрату тромбоцитів в середньому дорівнює 250-300 мл. За умови використання вищезазначеного способу сумарна кількість кріопротектору у лікувальній дозі становить 11,7г, що наближається до критичного показника залишкової дози і не дає змоги у разі необхідності збільшити кількість концентрату тромбоцитів, що використовують у лікувальних цілях.задачу створиВ основу винаходу поставлено ти такий спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів людини, який би, за рахунок зміни складу кріозахисного розчину та режиму охолодження, дозволив підвищити показники біологічної повноцінності клітин, а також знизити кількість кріопротектору в концентраті тромбоцитів. Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування концентрату тромбоцитів, який включає змішування його з кріозахисним розчином, що містить кріопротектор 1,2-пропандіол на аутологічній плазмі, програмне заморожування з послідуючим зануренням у рідкий азот, згідно з винаходом, кріозахисний розчин додатково містить кріопротектор ДМАЦ, при цьому кожний з кріопротекторів беруть в концентрації 0,3М, а заморожування здійснюють спочатку до температури кристалізації суспензії зі швидкістю 1град./хв, потім для зняття переохолодження проводять температурне ініціювання кристалоутворення і далі заморожують зі швидкістю 1град./хв до -35...-40°С з послідуючим зануренням у рідкий азот. Заявлений спосіб забезпечує одержання високих показників біологічної повноцінності клітин тромбоцитів після кріоконсервування: кількісна збереженість клітин 90,0±8,0%, РГШ 40,0±13,0%, агрегація на АДФ 66,7±12,0%. Повільні швидкості охолодження (1 гр/хв.) є найменш травматичними для тромбоцитів у температурному інтервалі до початку процесу кристалізації суспензії клітин. Температурне ініціювання кристалоутворення дає змогу зняти переохолодження клітинної суспензії і за рахунок цього знизити імовірність внутрішньоклітинної кристалізації, чим зменшити пошкодження клітин на етапі утворення твердофазної матриці. Додавання до кріозахисного розчину кріопротектору ДМАЦ знижує концентрацію 1,2-пропандіолу, а зменшена сумарна концентрація обох кріопротекторів нівелює їх токсичну дію на організм людини. Це дозволяє виключити процедури відмивання залишків криіпротектору і тим самим уникнути додаткової втрати і пошкодження клітин. Таким чином, спосіб, що 4 пропонується, дозволяє одержувати кріоконсервований концентрат тромбоцитів з високими показниками біологічної повноцінності та низькою кількістю кріопротектору, що дає змогу використовувати його у клінічній практиці. При використанні запропонованого способу сумарна кількість кріопротектору у лікувальній дозі складає: 1,2-пропандіолу - 6,48г, а ДМАЦ - 7,8г. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Концентрат тромбоцитів отримували шляхом фракціонування цільної донорської крові, заготовленої на консерванті "Глюгіцир" в потроєні полімерні контейнери "Гемакон". Виділення концентрату тромбоцитів здійснювали за допомогою рефрижераторної центрифуги УРЛ 0501 в перші 4 години після забору крові при температурі 22±2°С [6]. Перед проведенням заморожування концентрат тромбоцитів зберігали при постійному перемішуванні на автоматичній мішалці при 22±2°С протягом 18-20 годин. Кріозахисний розчин, який містив 0,3М (2,28%) 1,2-ПД та 0,3М (2,26%) ДМАЦ, вводили у концентрат тромбоцитів при 22°С у співвідношенні 1:1 протягом 1хв. Кінцевий об'єм зразка становив 1,6мл. Одразу ж після введення кріозахисного розчину в концентрат тромбоцитів проводили заморожування за допомогою програмного заморожувача "Cryoson" (Німеччина) у кріоампулах "Nunc". Заморожування проводили згідно з наступним режимом: від кімнатної температури до температури кристалізації кріозахисного розчину з концентратом тромбоцитів, яку визначали заздалегідь (-1,67°С) , швидкість охолодження становила 1 град./хв. Для зняття переохолодження при температурі кристалізації проводили температурну ініціацію. Далі охолоджували до температури -40°С зі швидкістю 1 град./хв., після чого зразок занурювали у рідкий азот. Відігрівання зразків здійснювали на водяній бані при температурі 37°С, після чого одразу проводили оцінку кількісної збереженості тромбоцитів. Оцінку морфо-функціональної збереженості тромбоцитів (РГШ та агрегації на АДФ) проводили після видалення кріопротектору [7]. Одержані після кріоконсервування показники біологічної повноцінності концентрату тромбоцитів виражали у відсотках по відношенню до відповідних показників до заморожування: кількісна збереженість клітин 90,0±8,0 %, реакція на гіпотонічний шок 40,0±13,0%, агрегація на АДФ 66,7±12,0%. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що для заморожування концентрату тромбоцитів використовували програму як зі зняттям переохолодження, так і без зняття переохолодження. Результати наведені у Таблиці 1. З Таблиці 1 видно, що найкращі показники біологічної повноцінності були отримані при застосуванні програми заморожування зі зняттям переохолодження. Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що брали різні концентрації кріопротекторів. Результати наведені у Таблиці 2, з якої видно, що найкращі показники біологічної повноцінності кріоконсервованого кон 5 84775 центрату тромбоцитів одержували при використанні обох кріопротекторів у концентрації 0,3М. Приклад 4. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, але заморожування перед занурюванням у рідкий азот проводили до різних температур. Результати наведені у Таблиці 3, з якої видно, що зниження кінцевої температури охолодження до 6 50°С не впливає на показники якості життєздатності концентрату тромбоцитів, але вимагає додаткового часу на охолодження та збільшує витрати рідкого азоту, тому оптимальною кінцевою температурою охолодження перед занурюванням у рідкий азот є -35...-40°С. Таблиця 1 Показники біологічної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів при застосуванні програм заморожування зі зняттям та без зняття переохолодження Режим охолодження Кількісна збереженість клітин, % Реакція на гіпотонічний шок, % Агрегація на АДФ, % 88,0±7,0 35,0±15,0 58,5±10,0 90,0±8,0 40,0±13,0 66,7±12,0 Без зняття переохолодження Зі зняттям переохолодження Таблиця 2 Показники біологічної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від концентрацій кріопротекторів 1,2-ПД та ДМАЦ Концентрації кріопроте- Кількісна збереженість клітин, кторів % 1,2-ПД(0,2М)+ДМАЦ 88,0±12,0 (0,2М) 1,2-ПД(0,3М)+ДМАЦ 90,0±8,0 (0,3М) 1,2-ПД(0,5М)±ДМАЦ 85,0±10,0 (0,5М) Реакція на гіпотонічний шок, % Агрегація на АДФ, % 30,0±10,0 60,0±13,0 40,0±13,0 66,7±12,0 27,0±12,0 42,0±8,0 Таблиця 3 Показники біологічної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від кінцевої температури охолодження перед занурюванням у рідкий азот Кінцева температура охолодження, °С Кількісна збереженість клітин, % Реакція на гіпотонічний шок, % Агрегація на АДФ, % -30 -35 -40 -50 86,0±11,0 37,0±15,0 62,5±13,0 89,0±10,0 39,0±10,0 67,0±10,0 90,0±8,0 40,0±13,0 66,7±12,0 91,0±12,0 40,0±11,0 67,1±14,0 Джерела інформації: 1. Balint В., Paunovic D., Vucetic D., Vojvodic D., Petakov M., Trkuljic M., Stojanovic N. Controlled-rate versus uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet cryopreservation efficacy // Transfusion.2006. - V. 46.-P. 230-235. 2. Криоконсервирование клеточных суспензий / Цуцаева А.А., Аграненко В.А., Федорова Л.И. и др. - Киев, 1983.- C.112-113. 3. Аграненко В.А., Файнштейн Ф.Э., Голубева В.Л., Абакумов Е.М., Воробьева Г.С. Криоконсервированные тромбоциты и их клиническая эффективность // Гематология и трансфузиология.-1987.№5.-С.8-12. 4. Arnaud F.G., Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets with propane-1,2-diol//Cryobiology.1990. - №27. - P. 130-136. 5. Временная фармакопейная статья для 1,2пропандиола, Москва, 1986. ВПС 42 - 1594 -86. 6. Аграненко В.А., Компаниец A.M., Балерина Л.В. и др. Выделение концентратов тромбоцитов из ЛТС донорской крови и их консервирование // Гематология и трансфузиология.- 1991.- Т.36, №3.- С. 29-32. 7. Грищенко B.I., Компанієць A.M., Книш О.В. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів. Патент України №15014, А01 N 1/02, 15.06.2006. 7 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 84775 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601