Спосіб виділення “стовбурових” та клітин-попередників гемопоезу пуповинної крові людини

Спосіб виділення "стовбурових" та клітинпопередників гемопоезу пуповинної крові людини, що включає процедуру вилучення еритроци CM CM CO O) 6221 (suppl. 1). - P. 409a], який є методом простого центрифугування з використанням трьохступеневої системи стерильних мішків для розділення цільної пуповинної крові на три фракції ("Buffy coat"- лейкоцитарний шар, шар еритроцитів та плазма). Така методика дозволяє сконцентрувати у зменшеному в два рази об'ємі „стовбурові" клітини пуповинної крові при дотриманні повної стерильності. Недоліком зазначеного способу є травматичність для „стовбурових" клітин та клітинпопередників гемопоезу процедури жорсткого центрифугування, яка є основним моментом, який забезпечує в даному випадку розділення цільної крові на шари, що призводить до втрати цих клітин як в момент виконання самої процедури, так і при подальшому їх заморожуваннівідтаюванні в наслідок втрати природної резистентності. Крім того, внаслідок такої сепарації неминуча кількісна втрата „стовбурових" та клітин-попередників гемопоезу, які механічно потрапляють в шар еритромаси під дією чинників жорсткого центрифугування. Розділення шарів білих клітин та еритроцитів в замкненій системі без використання допоміжних градієнтів розчинів по закінченню центрифугування є кропіткою процедурою, при якій навіть невелике взбовтування веде до змішування шарів клітин і, в наслідок цього, потребує повтору всієї процедури. Найбільш близьким за ознаками до способу, що заявляється, є спосіб, при якому процедура сепарації клітин пуповинної крові проводиться в присутності 3% розчину желатину при t +4°C [Harris D. Т., Schumacher M. J., Rychlik S. et al. Collection, separation, and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation// Bone Marrow Transplant. - 1994. - B13. - P. 135-143]. Недоліком зазначеного способу є необхідність в додатковому приготуванні та стерилізації 3% розчину желатину, що випускається у порошковій формі. Це ускладнює процес приготування суспензії гемопоетичних клітин пуповинної крові до кріоконсервування, а також сприяє дорожчанню процесінгу. Другим суттєвим недоліком способу э те, що процес ведуть при +4°С. В цих умовах розчин желатину різко збільшує свою в'язкість що відповідно суттєво уповільнює процес седиментації клітин та впливає на повноту розділення внаслідок чого підвищується відсоток втрат ядровмісних клітин в процесі підготовки суспензії. Завданням розробки є створення способу виділення гемопоетичних клітин пуповинної крові, в якому шляхом виконання способу в замкненій системі з застосуванням двоступеневої системи забору, застосуванням нової речовини та емпірично підібраних режимів здійснення способу забезпечується покращення умов стерильності способу, прискорення осадження еритроцитів, збільшення виходу ядровмісних клітин та загалом забезпечується спрощення способу, який є простим в використанні, не зв'язаний з використанням складної апаратури та технологій і є прийнятним для створення довгострокових банків „стовбурових" та клітин-попередників гемопоезу пуповинної крові, під час виконання процедури використову ються сертифіковані МОЗ України розчини одноразові матеріали та обладнання, при якому шляхом зміни колоїдного розчину для прискореного осадження еритроцитів, забезпечується спрощення способу, покращення умов стерильності, збільшення виходу ядровмісних клітин, а також мононуклеарів, до складу яких входять „стовбурові" та клітини-попередники гемопоезу. Спосіб передбачає здійснення процессу вилучення еритроцитів зі складу зразка шляхом вільного осадження еритроцитів в градієнті колоїдного розчину, який містить 4% модифікованого рідкого желатину. Новим в способі є застосування з метою прискореного „спонтанного" осадження еритроцитів колоїдного плазмозамінного розчину ГЕЛОФУЗИН, який містить 4% модифікованого рідкого желатину ( і який дозволено МОЗ України для внутрішньовенного застосування), зміна температурного режиму. Процес здійснюють в замкненій двохступеневій системі для забору крові (в якості якої може бути застосована, наприклад замкнена двохступенева система для забору крові HEMOCON (HELM PHARMACEUTICALS GMBH), яка сертифікована МОЗ України для клінічного використання). А осадження еритроцитів здійснюють при температурі 20-22°С протягом 45-60 хвилин. З метою концентрації „стовбурових" та клітин-попередників гемопоезу пуповинної крові в зразках після видалення більшості еритроцитів використовується процедура обережного центрифугування з метою зменшення об'єму зразка в 2-3 рази. Застосування нової сукупності ознак способу виділення гемопоетичних клітин пуповинної крові людини з використанням готового стерильного розчину (ГЕЛОФУЗИН®), якій містить рідкий желатин і який дозволено МОЗ України для внутрішньовенного застосування, здійснення процедури без додаткового контакту з клітинною суспензією, тобто в замкненій системі веде до спрощення способу, покращення умов стерильності, що робить спосіб зручним та цілком прийнятним при клінічному застосуванні. Зміна температурного режиму сепарації призводить до ефекту прискорення процедури седиментації, збільшення збереженості та клітинності зразка для кріоконсервування. Зазначені етапи виділення та концентрації не призводять до травмування для гемопоетичних клітин та відповідають вимогам економічності при створенні банків гемопоетичних клітин, завдяки зменшенню об'ємів, що зберігаються. Для порівняння прототипу та запропонованого способу здійснювали обидва способи на зазначених нижче прикладах 1-10. Приготування клітинної суспензії за прототипом та за запропонованим способом здійснювали паралельно на одних і тих самих зразках пуповинної крові. Цільну пуповинну кров для досліджень брали в однаковій кількості. В таблицях при описі прикладів під цифрою 1 зазначені досліди, виконані за прототипом, а під цифрою 2 - досліди, виконані за способом, що пропонується. 6221 При проведенні сепарації клітин за прототипом застосовували розчин, який містить желатин в концентрації 3% (до складу розчину входять також глюкоза, кислий цитрат натрію, вода бідестильована). Після приготування, розчин розливали у флакони місткістю 50мл, які герметизували та стерилізували в режимі автоклавування (1,2атм протягом ЗОхв). Змішування проводили шляхом поступового нашарування розчину желатину на нативну пуповинну кров у співвідношенні розчин/кров =1:1. Після обережного змішування рідин шляхом погойдування, препарат залишали для вільного прискореного осадження еритроцитів при ї +4°С на штативі в камері холодильника протягом 45, 55, 60хв. (термін осадження співпадав в першому і другому паралельних прикладах у всій серії експериментів). Потім надосадову рідину за допомогою плазмоекстрактора переводили в парний мішок і центрифугували в режимі 1200об/хв, протягом 8хв. Після цього вільну від клітин плазму обережно видаляли, клітинний осад ресуспендиювали в плазмі, що залишилась. Після цього проводили підрахунок клітин в суспензії, вивчали їх життєздатність за методом суправітального зафарбовування, а також вивчали клітинний склад суспензії в мазках. При виконанні прикладів за способом, що пропонується, в порт основного мішка системи для збору крові HEMOCON до цільної пуповинної крові обережно додавали колоїдний плазмозамінний розчин, який містить 4% модифікованого рідкого желатину (ГЕЛОФУЗИН), в співвідношенні 1:1. Мішок підвішували на штатив на 45, 55, 60хв. (у відповідності до першого прикладу, термін процедури відстоювання залежить від реологічних якостей конкретного зразка) при температурі (t=(20-22)°C. По закінченню процедури відстоювання надосад переводили за допомогою плазмоекстрактора в другий мішок двухступеневої системи, після чого трубку, яка їх з'єднує перетинали та герметично запаювали. Лейкоконцентрат, який містить гемопоетичні клітини пуповинної крові концентрували шляхом обережного центрифугування в режимі 1200об/хв протягом 8хв при кімнатній температурі. Вільний від клітин надосад обережно видаляли, а клітини ресуспендиювали в надосадовій рідині, яка залишилась. Вивчення ефективності способу проводили за вищевикладеною при описі прототипу схемою. При цьому було виявлено, що процент мононуклеарів, що виділені за прототипом, від загального їх вмісту в нативній крові менше, ніж при виділенні за способом, що пропонується. Крім того, при застосуванні методу прототипу втрата ядровмісних клітин в цілому є значно більшою, що буде відбиватись на якості зразка. Життєздатність клітин в суспензії для кріоконсервування залишається незмінною. Результати, представлені в таблиці 2, свідчать, що осідання еритроцитів за прототипом є набагато повільнішим, і таким чином подовжується процедура седиментації. При цьому надаються умови, які суперечать вільному осадженню еритроцитів: розчин желатину при зниженні тем ператури формує гелеобразну структуру, котра сприяє як затриманню еритроцитів, так і „змішуванню" ядровмісних клітин, які мають високу щільність, з такими еритроцитами. Крім того, при температурі, близькій до нульової, ядровмісні клітини „сенсибілізуються" до умов низьких температур, що додатково спричинює зниження їх збереженості при подальшому заморожуванні-відтаюванні. Бактеріологічний контроль підготовлених за прототипом та за способом, що заявляється, на відсутність бактеріальної та грибкової контамінації здійснювали згідно з "Інструкцією з контролю стерильності консервованої крові, її компонентів, препаратів, консервованого кісткового мозку, плазмозамінюючих та консервуючих розчинів, умов їх заготівлі", 1999р. Результати бактеріологічного контролю, представлені в таблиці 3, свідчать, що зразки, підготовлені за прототипом мають значно більший відсоток контамінації мікрофлорою, ніж зразки, підготовлені за способом, що заявляється. Це свідчить про збільшення вірогідністі порушення стерильності, пов'язану з необхідністю приготування 3 % розчину желатину, а також з необхідністю внесення мішків з матеріалом в холодильну камеру для осадження при температурі +4° С Таким чином, як видно з отриманих результатів, запропонований спосіб має кращі результати збереженості як мононуклеарних клітин, до яких відносяться „стовбурові" та клітинипопередники гемопоезу, так і ядровмісних клітин вцілому. При цьому використання рідкого стерильного розчину желатину, яким є ГЕЛОФУЗИН, значно спрощує і скорочує процедуру виділення гемопоетичних клітин пуповинної крові. Всі етапи процедури є такими, що бережуть клітини від жорстких механічних пошкоджень. Результатом проведення процедури є суттєве зменшення об'ємів зразків пуповинної крові, звільнення їх від основної маси еритроцитів, що суттєво підвищує якість суспензії клітин, а також є економічно вигідним при створенні банків пуповинної крові. Розчин ГЕЛОФУЗИН, який застосовується в якості осаджуючого - сертифікований МОЗ України в якості ефективного плазмозамінного розчину гемодинамічної дії, що дозволяє використовувати виділені способом, що заявляється, гемопоетичні клітини в більшості терапевтичних випадків. Завдяки використанню замкненої системи виділення клітин, одноразових матеріалів, які мають дозвіл для клінічного застосування, як стерильні, нетоксичні, апірогенні, спосіб відповідає умовам стерильності в роботі з консервованою кров'ю, її компонентами, препаратами та вимогам до їх заготівлі. Зазначені переваги, як показують приклади, призводять до збільшення виділення мононуклеарних клітин, до яких відносять „стовбурові" та клітини-попередники гемопоезу, а також ядровмісних клітин, що призводить до збільшення клітинності і, таким чином, дози компоненту крові, яким є завись гемопоетичних клітин пуповинної крові для кріоконсервування з метою подальшого клінічного застосування. 6221 Таблиця 1 № прикладу 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Спосіб, за яким проведено виділення гемопоетичНИХ КЛІТИН 1-прототип, 2-зявлений спосіб 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 КІЛЬКІСТЬ ядров- Відсоток втраЗагальна КІЛЬти ядровмісМІСНИХ КЛІТИН В Кл іти н-н їсть КІСТЬ ядровмісних клітин в суспензії в резразка, них клітин в 20 зультаті прове- процесі підгомл пуповинної (109/л) дення виділення, товки суспенкрові, (109) зи,(%) (Ю9) 6 5 4 3 0,225 25 15,45 0,3 0,255 15 15,45 0,3 0,196 20 12,25 0,245 0,221 10 12,25 0,245 21 0,391 24,75 0,495 12 0,436 24,75 0,495 0,189 18 11,5 0,23 14 0,198 11,5 0,23 0,457 28,2 0,564 19 0,513 28,2 0,564 9 0,274 17 16,5 0,33 0,294 11 16,5 0,33 0,204 0,161 21 10,2 10,2 0,204 0,172 16 0,265 25 17,65 0,353 0,321 9 0,353 17,65 22 0,427 0,333 21,35 0,427 0,384 10 21,35 18,4 0,368 0,272 26 18,4 0,368 0,339 8 Доля виділених мононуклеарів від загальної їх КІЛЬКОСТІ В 20 МЛ цільної пуповинної крові,(%) 7 87 93 88 92 85 94 80 93 83 95 85 91 82 90 80 98 78 95 79 93 Життєздатність ядровмісних клітин в суспензії пуповинної крові для крюконсервування, (%) 8 98 97 96 97 98 98 99 98 99 100 96 96 97 95 98 99 96 95 97 98 Таблиця 2 № п/п 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Спосіб, за яким проведено виділення гемопоетичних клітин 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Доля над осадової рідини від загального об'єму суміші пуповидної крови з колоїдним розчином,(%) Через 45 хв відстоюванЧерез 55 хв відстоювання Через 60 хв відстоювання ня 3 4 5 45 25 35 50 45 48 27 43 35 47 52 55 34 48 20 60 55 58 27 48 38 52 57 62 47 ЗО 38 50 55 53 33 40 25 55 58 60 45 25 35 54 60 65 47 32 40 57 60 62 36 42 ЗО 64 58 68 33 42 23 51 55 58 Таблиця З № п/п 1 1 2 Спосіб, за яким проведено виділення гемопоетичних клітин 2 прототип зявлений спосіб Комп'ютерна верстка Н. Лисенко КІЛЬКІСТЬ зразків, що пе КІЛЬКІСТЬ виявлених не ревірено на стерильність 3 20 250 4 5 5 Відсоток нестерильних зразків стерильних зразків Підписне 5 25% 1,25% Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601