Пристрій для експресного аналізу біомолекулярних середовищ на основі ефекту поверхневого плазмонного резонансу

Винахід відноситься до області розробки оптоелектронних твердотільних сенсорних пристроїв для хімічного і біологічного аналізу, заснованого на реєстрації адсорбції або реакції взаємодії молекул у газовому і рідкому середовищах. Розглянуті прилади дозволяють робити швидкий і економічний моніторинг навколишнього середовища, а також експресний аналіз клінічних рідин, складу продуктів харчової, фармацевтичної промисловості і виробничих відходів. Відомий сенсор на основі явища поверхневого плазмонного резонансу United States Patent: 6.480.282. МПК G01N021/05. Capillary surface plasmon resonance sensor and multisensors / Chinowsky T.M., Yee S.S.; November 12, 2002. Прилад містить призму повного внутрішнього відбивання з металевою плівкою, джерело р-поляризованого монохроматичного випромінювання, що опромінює металеву плівку з боку призми і приймач відбитого світла. Принцип роботи сенсора полягає у вимірюванні інтенсивності відбитого від металевої плівки монохроматичного світла при зміні кута падіння (резонансна крива поверхневого плазмонного резонансу (ППР)) і дослідженні даної залежності в умовах адсорбції чи взаємодії молекул, що відбуваються на протилежній стороні металевої плівки. У наведеному пристрої вимір кривої відбивання здійснюється з використанням широкого світлового променя, що покриває певний інтервал кутів падіння і сходиться в одній точці на металевій поверхні, при цьому відбиті сигнали експонуються на лінійку фотодіодів. Процес адсорбції біологічних молекул на сенсорну поверхню аналогічний формуванню шару молекул з певним коефіцієнтом заломлення та товщиною. При цьому форма резонансної кривої та положення мінімуму будуть змінюватися. Таким чином, прилад дозволяє з високою швидкістю детектувати процеси адсорбції і взаємодії молекул, що відбуваються на сенсорній поверхні за рахунок визначення положення мінімуму резонансної кривої з плином часу при скануванні лінійки фотоприймачів. Головним недоліком описаної сенсорної системи є малий кут сканування, який дозволяє досліджувати шари з коефіцієнтом заломлення в діапазоні 1,33-1,38, що обмежує середовище дослідження. Істотним недоліком є також складність і висока вартість приладу. Найбільш близьким до пристрою, що заявляється, можна вважати прилад для детектування і визначення концентрації біомолекул Патент України: 46018, МПК G01N21/55. Спосіб детектування та визначення концентрації біомолекул та молекулярних комплексів та пристрій для його здійснення / Ширшов Ю.М., Венгер Є.Ф., Прохорович А.В., Ушенін Ю.В., Мацас Є.П., Чегель В.І., Самойлов А.В.; Заявл. 22.10.1997; Опубл. 15.05.2002; Бюл. №5. Прилад містить призму з оптично більш щільної речовини, межу поділу з оптично менш щільною речовиною, металеву плівку на зазначеній межі, джерело монохроматичного світла, яке розташоване з боку більш щільного середовища, блок керування поворотом призми щодо джерела випромінювання і фоточутливий елемент. Спосіб детектування і визначення концентрації біомолекул і молекулярних комплексів полягає в опроміненні металевої плівки з боку призми в широкому діапазоні кутів падіння, що досягається механічним поворотом призми, реєстрації відбитої інтенсивності для всього набору кутів падіння і математичну обробку даних вимірів по спеціально розробленому алгоритму. При цьому механічна система сканування кута в широкому діапазоні не накладає обмежень на характер середовища і досліджуваних молекул. Основним недоліком пристрою є неможливість відстеження в реальному часі досить повільних процесів, оскільки для визначення мінімуму резонансної ППР кривої необхідно зняти всю криву чи її частину, тому на одне сканування звичайно витрачається кілька хвилин. Оскільки процес вимірів автоматизований, обов'язковою умовою функціонування приладу є наявність комп'ютера і програмного забезпечення, що робить прилад досить дорогим і складним у використанні. При роботі з таким приладом необхідно використовувати спеціально підготовлених операторів високої кваліфікації. Таким чином, аналіз приведених сенсорних пристроїв, що використовують ефект поверхневого плазмонного резонансу для детектування процесів адсорбції і взаємодії молекул показує, що не існує приладу, у якому б оптимально сполучалися недорога і проста у виготовленні конструкція з високою швидкістю вимірів. В основу винаходу, що заявляється, поставлена задача підвищення швидкодії проведення аналізу біомолекулярних середовищ, значного спрощення конструкції сенсорного приладу на основі ефекту поверхневого плазмонного резонансу і значного здешевлення приладу при збереженні його високої чутливості. Поставлена задача досягається тим, що в пристрої для аналізу біомолекулярних середовищ, що містить призму повного внутрішнього відображення з нанесеним на її поверхню плівковим металевим робочим елементом, освітлювальну систему р-поляризованого монохроматичного світла, розташовану таким чином, щоб випромінювання падало на робочий елемент з боку призми, пристрій повороту призми щодо освітлювальної системи і систему детектування світла, відбитого від робочого елемента, освітлювальна система містить два ідентичних джерела світла, розташованих таким чином, щоб їхнє випромінювання падало на робочий елемент в одну точку зі зсувом по куту падіння, а система детектування містить два фоточутливих елемента і пристрій порівняння вихідних сигналів фоточутливих елементів. Основна відмінність пристрою, що заявляється, від прототипу полягає в можливості вибору характеристичного параметра резонансної кривої, який у свою чергу є вихідним параметром сенсорного приладу, відмінного від тих, що традиційно використовуються. У прототипі - це кутове положення мінімуму резонансної кривої. Процедура одержання вихідної характеристики приладу, а саме - залежності зміни кута плазменного резонансу з плином часу, складається у вимірі крок за кроком усієї резонансної кривої чи її частини, при цьому на виконання кожного кроку витрачається кілька хвилин. У пристрої, що заявляється, значно зменшується час на проведення аналізу біохімічних реакцій (підвищення швидкодії), оскільки характеристичним параметром резонансної кривої є величина кута сканування, при якій різниця інтенсивностей відбитих сигналів від двох джерел при наявності різниці в кутах падіння мінімальна. Таким чином, щоб зафіксувати факт протікання біомолекулярної реакції необхідно просто порівняти сигнали двох фоточутливих елементів, що можна зробити протягом декількох секунд. Пропонований у винаході спосіб одержання вихідної інформації не вимагає операцій, програмно керованих за допомогою комп'ютера. Тому значно спрощується конструкція приладу, зменшуються його габарити і знижується вартість. Таким чином, пропонований пристрій забезпечує значне збільшення швидкодії при збереженні його високої чутливості, конструкція приладу спрощується, знижується його вартість, що відкриває можливість створення переносних експрес-лабораторій. На фіг.1 - приведена блок-схема ППР пристрою, робота якого заснована на дослідженні кутової залежності інтенсивності відбитого від робочого елементу сенсора світла, де 1 -джерело р-поляризованого монохроматичного світла, 2 - призма повного внутрішнього відбивання, 3 - плівковий металевий робочий елемент (переважно Au, Ag), у якому відбувається збудження поверхневих плазмонів, 4 - проточна кювета для подачі досліджуваної проби, 5 - фотодіод для реєстрації світла, відбитого від межі поділу призма/металева плівка. Фіг.2 - демонструє резонансну ППР криву, тобто залежність інтенсивності відбитого світла від кута падіння (1) і динаміку її зміни при збільшенні товщини адсорбованого шару молекул білку: 2-1нм, 3-5нм, 4-10нм. На фіг.3 - приведена блок-схема пристрою, що заявляється, де 1 - призма повного внутрішнього відбивання, 2 - тонка металева плівка (Аu - 45нм), 3 - освітлювальна система, що містить два ідентичних джерела монохроматичного р-поляризованого світла, 4 - детектуюча система, що складається з двох фоточутливих елементів (5,6) і пристрій порівняння вихідних сигналів фоточутливих елементів (7). На фіг.4 - показані резонансні криві, отримані в результаті опромінення робочого елемента пристрою двома ідентичними джерелами світла в одній точці зі зсувом по куту падіння (А). Характеристичним параметром кривої ППР у пристрої, що заявляється, є величина кута падіння (Б), при якій різниця інтенсивностей двох відбитих сигналів мінімальна. Представлений винахід зв'язаний з розробкою сенсорного приладу, що використовує явище оптичного збудження поверхневої електромагнітної хвилі (інакше поверхневих плазмонов-ПП) у тонкій металевій плівці (Поверхностные поляритоны. Электромагнитные волны на поверхностях и границах раздела сред / Под редакцией: В.М. Аграновича, Д.Л. Миллса, Москва: Наука, 1985, 525с.; Н.Л. Дмитрук, В.Г. Литовченко, В.Л. Стрижевский, Поверхностные поляритоны в полупроводниках и диэлектриках, Киев: Наукова думка, 1989, 375с.), для швидкої ідентифікації молекулярних взаємодій. Ефект виникає при взаємодії електромагнітного випромінювання видимого діапазону з межею поділу двох середовищ. При цьому, умовою існування ПП є наявність у робочому діапазоні негативної діелектричної проникності в одного з середовищ, що граничать. Оскільки для металів діелектрична проникність, обумовлена плазмою вільних електронів, негативна в широкому спектральному діапазоні, металева плівка (переважно Аu чи Ag) на діелектричній підкладці є чутливим елементом ППР сенсора. Явище ППР полягає в різкому зменшенні інтенсивності світла, відбитого від вищевказаної границі поділу, що спостерігається при специфічній довжині хвилі і специфічному куті падіння. Для того, щоб одержати резонансну ППР криву можна або змінювати довжину хвилі падаючого світла при фіксованому куті падіння, або використовуючи монохроматичне випромінювання змінювати кут падіння. При цьому відомі три способи для збудження ПП з використанням: металізованих дифракційних ґраток (Н. Raether "Surface Polaritons", Eds. Agranovich and Mills, North Holland Pubi. Соmр., Amsterdam, 1982), металізованої скляної призми (Кречман конфігурація) чи призми в близькому контакті з металізованою скляною підкладкою (Отто конфігурація). Форма резонансної кривої і положення мінімуму будуть визначатися оптичними характеристиками всієї структури в цілому, включаючи середовище, що контактує з металевою плівкою з протилежної сторони. Таким чином, ППР - це оптоелектронне явище, що використовується для розробки чуттєвих тонкоплівкових рефрактометрів, яке легко можна застосувати для аналізу біомолекулярних середовищ (Liedberg В., Nylander C., Lundstrom I. Biosensing with surface plasmon resonance - how it all started // Biosensors and Bioelectronics. - 1995. 10.- P. i-ix; Sambles, J.R. et al. Optical excitation of surface plasmons: an introduction // Contemp. Phys. - 1991. - 32. P.173-183; Gomes P., Andreu D. Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor // Journal of immunological methods. - 2002. - 259. - P.217-230; Tombelli S., Minunni M, Mascini M. A surface plasmon resonance biosensor for the determination of the affinity of drugs for nucleic acids // Anal. Lett. - 2002. - 35(4). - P.599-613.). Зокрема, на фіг.1. приведена поширена блок-схема ППР сенсора, робота якого заснована на дослідженні кутової залежності інтенсивності відбивання при фіксованій довжині хвилі падаючого випромінювання. Поверхневі плазмони збуджуються в тонкому металевому шарі (3), нанесеному на сторону скляної призми (2) в умовах повного внутрішнього відбивання від межі поділу призма-метал, при цьому зовнішня сторона плівки металу контактує з досліджуваною пробою через кювету (4). Резонансне зв'язування між фотонами джерела рполяризованого монохроматичного світла (1) і електронною плазмою на зовнішній поверхні металу відбувається в результаті падіння світла з боку призми і сканування внутрішньої сторони металевої плівки в діапазоні кутів більше критичного поворотом призми. Проявом такого зв'язування є зменшення інтенсивності відбитого світла при специфічному куті падіння (фіг.2), яке фіксується фотодіодом (5). Таким чином, формується основна характеристика приладу - резонансна крива відбивання, параметри якої визначаються діелектричними властивостями контактуючих середовищ. Форма кривої плазмонного резонансу і, зокрема, положення мінімуму, залежать: від показника заломлення призми, оптичних констант і товщини металевої плівки, у якій збуджується поверхневий плазмонний резонанс, та від оптичних параметрів і товщини шару, що контактує з металевим робочим елементом. Фіксуючи зміну резонансних умов виникнення плазмонного ефекту, тобто досліджуючи зміну положення мінімуму плазмонного резонансу у часі, можна зробити висновки про процеси адсорбції та взаємодії молекул, що відбуваються на розглянутій межі поділу та характеризувати їх кількісно. Однак, для визначення мінімуму резонансної ППР кривої необхідно зняти всю криву або її частину, тому на одне сканування звичайно витрачається кілька хвилин. Далі, аналіз кутового положення і форми резонансної кривої реєструється керуючою програмою, що дозволяє одержувати в реальному масштабі часу кінетичну криву (сенсограму), яка свідчить про процеси адсорбції та взаємодії біологічних молекул, присутніх у досліджуваній рідкій пробі. Результати вимірів математично обробляються по спеціально розробленому алгоритму. Блок-схема пристрою, що заявляється, для експресного аналізу біомолекулярних середовищ на основі ефекту поверхневого плазменного резонансу представлена на фіг.3. Пристрій містить призму повного внутрішнього відбивання (1) з нанесеним на її поверхню металевим плівковим робочим елементом (2). Освітлювальна система (3) містить два ідентичних джерела р-поляризованого монохроматичного світла. Випромінювання від цих двох джерел попадає на робочий елемент з боку призми в одну точку, але з визначеним зсувом по куті падіння (А). Світло, що відбивається від межі поділу призма-металева плівка, попадає на систему детектування світла (4), що містить два фоточутливих елементи (5-6) і пристрій порівняння вихідних сигналів фоточутливих елементів (7). Повертаючи призму щодо освітлювальної системи, ми змінюємо кут падіння випромінювання на робочий елемент сенсора. А за допомогою двох фоточутливих елементів фіксуємо величину інтенсивності відбитого світла. Отже, ми можемо знімати одночасно дві резонансні криві, параметри яких визначаються діелектричними властивостями контактуючих середовищ і, зокрема, залежать рід оптичних параметрів і товщини молекулярного шару, адсорбованого на металевий робочий елемент сенсору. У цьому випадку у якості характеристичного параметра резонансної кривої, що у свою чергу є вихідним параметром сенсорного пристрою, можна вибрати величину кута падіння (Б), при якій різниця інтенсивностей відбитих сигналів від двох джерел є мінімальною (фіг.4). Таким чином, щоб зафіксувати факт протікання біомолекулярної реакції на поверхні робочого елементу сенсора, потрібно за допомогою пристрою порівняння вихідних сигналів фоточутливих елементів (7) виміряти різницю інтенсивностей двох відбитих сигналів при визначеному куті сканування. Отже, на одержання вихідної характеристики приладу витрачається кілька секунд і немає необхідності у вимірі крок за кроком усієї резонансної кривої чи її частини для визначення резонансного мінімуму. Пропонований у винаході спосіб одержання вихідної інформації не вимагає операцій, програмне керованих за допомогою комп'ютера. Тому значно спрощується конструкція приладу, зменшуються його габарити та значно знижується вартість.