Спосіб діагностики вірусного лейкозу великої рогатої худоби імуносенсором поверхневого плазмонного резонансу

Спосіб діагностики вірусного лейкозу великої рогатої худоби шляхом взаємодії антигену зі специфічними антитілами, який відрізняється тим, що утворення специфічного імунного комплексу реєструють за допомогою імуносенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу (ППР), для тестування сироваток крові у вимірювальну комірку приладу ППР вводять розчин специфічного антигену, виділеного з ретровірусу типу С (білки gp51, p24) в забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) при рН 7,4, витримують його 20 хв. при кімнатній температурі, промивають комірку дистильованою водою, вносять до неї 1%-й розчин бичачого сироваткового альбуміну (БСА), витримують його 10 хв. при кімнатній температурі, промивають комірку ЗФР і реєструють резонансний кут, далі комірку наповнюють розчином досліджуваної сироватки крові в розведенні 1:1000, інкубують протягом 10 хв., промивають комірку ЗФР, що містить 0,1% твин-20, реєструють відгук імунного сенсора, визначають зсув резонансного кута, величина якого пропорційна рівню специфічних антитіл до вірусу лейкозу та є показником наявності захворювання. UA (21) 2002043144 (22) 17.04.2002 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. № 11, 2006 р. (72) Стародуб Микола Федорович, Пирогова Людмила Віталіївна (73) Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України (56) Болтовець П. М., Бойко В.Р., Дяченко Н.С., Снопок Б. А., Ширшов Ю. М. Застосування метода поверхневого плазмонного резонансу для виявлення вірусних антигенів. - Вісник Біологія. - Випуск 35, 2001, стр. 9-11. Lofas S., Malmqvist M., Ronnberg I., Stenberg E. et al.: Bioanalysis with surface plasmon resonance.// Sensor and actuators. - 1991. - B 5. - P. 79-84. Пирогова Л. В., Стародуб М. Ф., Артюх В. П., Нагаева Л. I. Експресна діагностика лейкозу великої рогатої худоби за допомогою імунного сенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу. Укр. біохім. журн., 2002, т. 74, №3, с. 88-92. Jiri Hоmola, Sinclair S. Yee, Gunter Gauglitz. Surface plasmon resonance sensors: review. - Sensors and Actuators. B 54 (1999) 3-15. C2 2 (19) 1 3 53267 4 Недоліками методу є недостатньо висока чутлиwith surface plasmon resonance. // Sensor and вість та дуже велика тривалість виконання аналізу actuators. - 1991. - В.5 - P.79-84]. (2-3 доби). [Оuchterlony Ö. Acta. Path. Microbiol. В даній розробці був використаний варіант Scand. 1953. - V32. N321]. ППР, де, у якості трасдюсора (сенсорного чипа) Великого розповсюдження набули різні модивикористовується тонка плівка золота (20нм), що фікації твердофазних імунохімічних методів наносилась на скляну пластинку, шляхом напи(ELISA). Зокрема, описано метод ELISA для діаглення у вакуумі. Цей сенсорний чип дозволяє, з ностики лейкозу великої рогатої худоби. Процедувеликою чутливістю, виявляти речовини, при рера визначення включає адсорбцію антигену на єстрації імунореактивної взаємодії та явища повеповерхні полістиролового планшету, в розрахунку рхневого плазмонного резонансу. 0,1мл на лунку (розчин антигену готують в 0,1Μ При перевищенні критичного кута плоскофосфатному буфері з рН 7,8) протягом 1 години поляризованого променю світла, при найвищому при 37°С. Далі розчини виливають і лунки промизначенні коефіцієнта заломлення, відбувається вають 3 рази по 2хв. фізіологічним розчином з рН повне внутрішнє віддзеркалення. В цих умовах, в 7,4, що містить поверхнево активні речовини поверхневих плазмонних полярітонах, спостеріга(0,85% NaCl, 0,05% ПАВ). У лунки, з адсорбованим ють, обумовлений перекачкою енергії випромінюна них антигеном, вносять по 0,1мл сироватки та вання, резонансний мінімум залежності інтенсивінкубують при 37° С при постійному перемішуванні ності віддзеркалення випромінювання від кута реакційної суміші на шуттель-апараті протягом падіння лазерного променю на плівку золота. Вза20хв. Після цього розчини виливають, лунки панеємодія антигену (білок р24- вірусу лейкозу великої лей промивають 3 рази фізіологічним розчином. У рогатої худоби) із специфічними до цього білка відмиті лунки вносять по 0,1мл робочого розвеантитілами, реєструється по зміні кута віддзеркадення кон'югата специфічних антивидових антитіл лення по типу, зазначеної вище, залежності, що із ферментом та інкубують протягом 20хв. на шутобумовлює можливість моніторингу процесу зв'ятель-апараті при 37°С. після відмивки в лунки пазування антигену з антитілом і врешті решт обунелей вносять субстрат ферменту ортофенілендімовлювати високу чутливість при визначенні рівня аміна (ОФД) та інкубують протягом 10хв. при 37°С антигену, а значить і можливість ранньої та статина шуттель-апараті. Реєстрацію результатів простично достовірної діагностики лейкозу великої водять візуально по зміні кольору або на спектророгатої худоби. фотометрі при довжини хвилі 405нм. Спосіб доАналіз здійснюється наступним чином. На позволяє визначити 1-10нг/мл специфічного білка. верхню трансдюсера іммобілізують антиген або [SU 17305 Α1 30.04.92, Бюл. №16, G01N33/543]. антитіла, попередньо розчинених у забуференому Недоліками цього методу є те, що він потрефізіологічному розчині (ЗФР) рН 7,4, 140мМ NaCl бує коштовних реактивів, послуг висококваліфікопротягом 15-20хв. при кімнатній температурі. Далі ваного персоналу, а також не менше 6 годин для вимірювальну комірку промивають ЗФР і реєструздійснення аналізу, причому, в умовах добре обють величину резонансного кута. Після цього коміладнаної лабораторії. Усе, вище згадане, обумоврку наповнюють розчином антитіл або антигену, лює високу вартість аналізу. фіксують величину кута. При утворенні на поверхні В основу запропонованого винаходу поставтрансдюсера імунних комплексів спостерігається лено завдання розробки нового методу діагностизсув резонансного кута. Зміна величини кута заки вірусного лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) лежить від кількості утворених імунокомплексів і на основі використання відомого явища поверхнепропорційна концентрації специфічних антитіл або вого плазмонного резонансу (ППР), який застосоантигену в досліджуваному розчині. ваний в аналогу "для визначення антигенів та анТестування сироваток на наявність у них антититіл (IgE), який дозволяє безпосередньо тіл, специфічних до білків gp51 та р24 ретровірусу реєструвати факт взаємодії антиген-антитіло в проводили наступним чином. Спочатку реєструварежимі реального часу. При падінні плоскополяріли резонансний кут при введенні у вимірювальну зованного лазерного променя на поверхню золота, комірку (об'ємом 10мкл) дистильованої води (конпри визначеному (критичному) куті, виникає явище троль). Потім у неї вводили розчин специфічного поверхневого плазмонного резонансу, яке появляантигену, витримували його там 20 хвилин при ється у виникненні осциляції щільності зарядів на кімнатній температурі, промивали комірку дистимежі між двома середовищами з диалектричними льованою водою для видалення надлишку антигеконстантами протилежного знаку. Наприклад, між ну, що не сорбувався на поверхні, та реєстрували металом та діелектриком. Частина енергії променя зсув резонансного кута. Для запобігання подальвитрачається на осциляцію і тому інтенсивність шого неспецифічного зв'язування компонентів сивіддзеркаленого променя, при визначеному (крироватки вільні місця зв'язування на поверхні трантичному) куті, зменшується, а кут віддзеркалення є сд'юсера блокували за допомогою 1% розчину сталою характеристикою конкретного стану трансБСА, який вносили в комірку, витримували його дюсора. При іммобілізації антигену (антитіла ) на там 10хв. при кімнатній температурі, після чого поверхню золота критичний кут , при якому виникомірку промивали ЗФР і реєстрували покази прикає поверхневий плазмонний резонанс змінюється ладу. Далі комірку наповнювали розчином анти і величина зсуву кута знаходиться в прямій залежсироватки, послідовно зменшуючи кратність розності від концентрації реагенту, який визначається. ведення: 1:20000; 1:1000. Час інкубації для кожної Чутливість визначення імунореагентів становить проби був 10 хвилин. Кожного разу комірку промивали буфером, що містив 0,1% твин-20 в ЗФР, для 5 g/ml. [S. Löfas, Μ. Malmqvist, І. Rönnberg, Ε. видалення елементів, що не зв'язалися і після Stenberg, В. Liendberg, I. Lundström. Bioanalysis 5 53267 6 цього реєстрували відгук імунного сенсора. ред методами, якими користуються у поточний На Фіг.1 показано відгук сенсора на внесення час: Ухтерлоні до 72 годин або ELISA 6-7 годин, біологічних компонентів. 1 - буферний розчин ; 2 при досить високій вартості аналізу. Таким чином, антиген; 3 - анти сироватка (1: 20000); 4 - анти технічним результатом, якого можна досягти при сироватка (1:1000). використанні запропонованого способу, є те, що На Фіг.2 показано величину зсуву резонансноцей спосіб може використаний як для скринінгу, го кута імунного сенсора, як показник наявності так і моніторингу великих гуртів великої рогатої антивірусних антитіл. 1-3 - хворі тварини, РІД (Уххудоби з метою їх, оздоровлення, оскільки в силу терлоні)- негативні, здорові корови, відповідно. своїх властивостей і переваг дозволяє здійснюваВісь ординат - кутові секунди; вісь абсцис - розвети діагностику у польових умовах і в короткі термідення сироватки. ни. Сполучення результатів обстеження на наявЗ Фіг.2 видно, що запропонований діагностічність вірусного лейкозу ВРХ із вакцинацією та ний пристрій, дозволяє з більшою чутливістю, ніж вибраковкою дає реальну можливість звести до за методом РІД, виявляти хворих тварин. мінімуму рівень захворюваності на вірусний лейкоз Метод дозволяє скоротити час необхідний для серед ВРХ. Розробка може бути використання діагнозу лейкозу великої рогатої худоби, у разі компактного спеціалізованого приладу для діагнопопередньої підготовки трансд'юсерної поверхні, стики інфекційних хвороб, в тому числі і в польодо 10 хвилин, що є беззаперечною перевагою певих умовах. Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601