Спосіб визначення групи ризику щодо розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів

Спосіб визначення групи ризику щодо розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів, який відрізняється тим, що як маркер використовують однонуклеотидний поліморфізм +45T>G гену ADIPOQ і в разі виявлення гомозиготного генотипу роблять висновок про підвищений ризик виникнення цукрового діабету 2 типу. (19) (21) u201102989 (22) 14.03.2011 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) КАРАЧЕНЦЕВ ЮРІЙ ІВАНОВИЧ, ГОРШУНСЬКА МАР'ЯНА ЮРІЇВНА, АТРАМЕНТОВА ЛЮБОВ ОЛЕКСІЇВНА, ПОЛТОРАК ВІКТОРІЯ ВІТАЛІЇВНА, КРАВЧУН НОНА ОЛЕКСАНДРІВНА, ХИЖНЯК ОКСАНА ОЛЕГІВНА, ТИЖНЕНКО ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА, ЛЕЩЕНКО ЖАННА АНАТОЛІЇВНА, ГЛАДКИХ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, ПОЧЕРНЯЄВ АРТЕМ КОНСТЯНТИНОВИЧ, ОПАЛЕЙКО ЮЛІЯ АНАТОЛІЇВНА, ГРИНЧЕНКО ТАМАРА СТЕ 3 63864 кликають певний інтерес при дослідженні етіології цукрового діабету 2 типу, належить ADIPOQ [7-12]. Результати досліджень в різних етнічних групах вказують на перспективність аналізу ще одного поліморфізму гена ADIPOQ +45T>G [13]. Задача корисної моделі: розробка способу визначення групи ризику відносно розвитку цукрового діабету 2 типу серед осіб слов'янської приналежності (українців і росіян) України. Поставлена задача вирішується тим, що для визначення групи ризику щодо розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів, як маркер використовують однонуклеотидний поліморфізм +45T>G гена ADIPOQ і в разі виявлення гомозиготного генотипу роблять висновок про підвищений ризик виникнення цукрового діабету 2 типу. Технічний результат - підвищення точності оцінки ризику розвитку цукрового діабету 2 типу за рахунок розширення переліку маркерів цього захворювання. Однонуклеотидний поліморфізм +45T>G гена ADIPOQ є заміна тиміну на гуанін (T/G) в екзоні 2 (SNP +45T>G в Region Ex2+53T>G) [14]. Спосіб, що заявлено, реалізується таким чином. У особи, що досліджується, забирають 10 мл венозної крові. ДНК виділяється з лейкоцитів за допомогою іонообмінної смоли Челекс-100 (ChelexR100) [15]. Однонуклеотидну заміну, що локалізована в екзоні 2 гена адипонектину (SNP +45T>G), визначають шляхом ампліфікації в полімеразній ланцю 4 говій реакції, використовуючи прямий (APM45F GAAGTAGACTCTGCTGAGATGG) і зворотний (APM45R TATCAGTGTAGGAGGTCTGTGATG) праймери і ендонуклеазу SmaІ [16]. Як маркер молекулярної маси використовують ДНК pUC19, гідролізовану ендонуклеазою MspІ. Розділення фрагментів ДНК після рестрикції проводиться за допомогою електрофорезу в 2 % агарозному гелі. Електрофореграма ПЛР-продуктів (фіг.) дає уяву про генотипи донорів за геном ADIPOQ. На електрофорезних доріжках видно смуги: у першій - драбинку фрагментів ДНК маркера молекулярної маси pUC19/MspI, довжина рестрикційних фрагментів ДНК: 501; 489; 404; 331; 242; 190; 147; 111; 110; 67; 34; 26 пар нуклеотидів (фрагменти 67, 34, 26 не видно в агарозному гелі); в другій - одна смуга розміром 199 пар нуклеотидів (контроль рестрикції). В пробах, що досліджуються: одна смуга розміром 250 пар нуклеотидів - гомозиготний генотип ТТ (5 зразок), дві 135 і 115 пар нуклеотидів - гомозиготний генотип GG (3, 4 зразки), три 250, 135 і 115 пар нуклеотидів - гетерозиготний генотип TG (6-9 зразки). За нашими даними, частоти алелей гена ADIPOQ значуще не відрізняються у чоловіків і жінок, а також у росіян і українців, а також у хворих на цукровий діабет 2 типу і здорових людей. Розбіжності між хворими і здоровими стосуються розподілу генотипів: у хворих на цукровий діабет 2 типу спостерігається надлишок обох гомозигот GG та ТТ і нестача гетерозигот TG у порівнянні з групою здорових індивідів (табл. 1). Таблица 1 Частоти генотипів за однонуклеотидним поліморфізмом +45 T>G гена ADIPOQ у хворих на цукровий діабет (ЦД) 2 типу і здорових людей Генотипи TG Показник Розподіл генотипів у здорових осіб, % Розподіл генотипів у хворих на ЦД 2 типу, % Відносний ризик захворювання на ЦД 2 типу Абсолютний ризик захворювання на ЦД 2 типу, % На підставі цих даних одержані показники відносного ризику: для індивіда з генотипом +45GG ймовірність захворіти цукровим діабетом 2 типу в 5,76 разу перевищує середнє популяційне значення (2 %), для індивіда з генотипом +45ТТ ризик підвищений в 4,47 разу. Гетерозиготність за поліморфізмом TG ADIPOQ є фактором антиризику щодо цукрового діабету 2 типу - ймовірність захворювання для індивіда з генотипом +45TG на 30 % менше, ніж в середньому в популяції (табл. 1). З урахуванням даного поліморфізму можна одержати абсолютне значення ризику захворювання на цукровий діабет 2 типу у вивченому населенні. Для гомозигот GG він становить близько 12 %, для гомозигот ТТ - близько 9 %, а для гетерозигот TG менше ніж 1 %. Для оцінки ризику підраховували відношення шансів OR [17]. Цей показник розраховували за ТТ 4,81 21,52 4,47 8,94 92,31 61,89 0,67 1,34 GG 2,88 16,59 5,76 11,52 допомогою чотирипільної таблиці. Якщо клітини таблиці позначити а (хворий на цукровий діабет 2 типу за наявності даного генотипу), b (хворий на цукровий діабет 2 типу без даного генотипу), с (здоровий з даним генотипом), d (здоровий, що не має даного генотипу), то відношення шансів дорівнює: OR=ad/bc. Для знаходження статистичної похибки показника OR використовували логарифмічну шкалу. Для цього знаходили натуральний логарифм OR (lnOR), а його статистичну похибку slnOR розраховували за формулою: sInOR  (1/ a  1/ b  1/ c  1/ d). Статистичну похибку slnOR використовували для знаходження довірчого інтервалу (ДІ) логарифма відношення шансів ln OR: ДІ: lnOR±tslnOR, 5 63864 6 95 % ДІ OR: exp(lnOR – tslnOR)  exp(lnOR + tslnOR) де t - критерій Стьюдента (для 95 % інтервалу t=2). Потім за допомогою операції експонування знаходили довірчий інтервал для OR. Таблиця 2 Відношення шансів (OR) розвитку ЦД 2 типу для різних генотипів Вихідні дані d Генотип а ТТ TG GG GG, ТТ b 48 138 37 85 175 85 186 138 5 96 3 8 OR с 99 8 101 96 Як бачимо з табл. 2, гомозиготність за поліморфізмом +45T>G збільшує шанс захворіти на цукровий діабет 2 типу (ORGG=6,7, ORTT=5,4), а гетерозиготність зменшує ймовірність захворіти (ORTG = 0,13). Предикторна ємність визначення однонуклеотидного поліморфізму +45T>G ADIPOQ, щодо ризику розвитку цукрового діабету 2 типу, посилюється доведеним в наших дослідженнях найбільш вагомим модулюючим внеском генотипу до формування гіпоадипонектинемії та зниженої чутливості до інсуліну у пацієнтів з маніфестною стадією вищеозначеної патології. Так, у носіїв ТТ рівні циркулюючого адипонектину та індекс інсулінорезистентності (НОМА-IP) склали відповідно: 3,86±0,42 мкг/мл та 10,76±1,19 порівняно до 4,86±0,29 мкг/мл та 7,64±0,58 у гетерозигот TG (р